一种含有编码Mnp蛋白基因的酵母表达载体及构建、制备Mnp蛋白和降解木质素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于乳酸酵母细胞外分泌蛋白的表达载体基因工程研究技术领域，具体涉及一种用于乳酸酵母(Kluyveromyces lactis GG799)细胞外分泌香燕猛过氧化物酶(Μηρ)蛋白的表达载体。本发明还涉及该表达载体的构建方法。
【背景技术】
[0002]我国油菜种植面积大，油菜秸杆资源丰富。油菜秸杆中含有大量的纤维素(茎部达53%)、半纤维素(18.34%)等碳水化合物，是反刍动物的重要饲料来源(赵蒙蒙等，几种农作物稻杆的成分分析，材料导报，2011 (16):122-125)ο但生产中，油菜稻杆并没有被广泛的用于畜牧养殖业，大部分被直接焚烧(曹国良等，中国区域农田秸杆露天焚烧排放量的估算，科学通报，2007 (15):1826-183)或腐解还田，不仅浪费了资源，还严重污染环境。究其原因在于，油菜秸杆木质化程度高、秸杆粗硬、适口性差；油菜秸杆中木质素与纤维素形成坚固的酯键结构，抑制瘤胃微生物的降解，降低了瘤胃可消化性，若不加工处理，会影响动物米食量，降低生产性能(Ramirez-Bribiesca J E，Wang Y，Jin L，et al.Chemicalcharacterizat1n and in vitro fermentat1n of Brassica straw treated with theaerobic fungus， Trametes versicolor.Canadian Journal of Animal Science，2011，91(4):695-702)o以往多采用酸化、碱化等方式处理油菜秸杆，但其残留的酸碱，会对动物本身造成伤害，而且污染环境(张文杰等，秸杆处理方法的研究进展，中国畜牧兽医，2011
(07):30-33)。与上述化学方法相比，利用微生物发酵技术处理油菜秸杆，则绿色、安全、无污染，且可提高饲料的适口性和利用率。
[0003]白腐真菌是自然界中降解木质素最有效的微生物。用白腐真菌处理秸杆，能够显著的降低木质素含量，提高瘤胃利用率(Sharma R K，Arora D S.Product1n oflignocellulolytic enzymes and enhancement of in vitro digestibility duringsolid state fermentat1n of wheat straw by Phlebia floridensis.B1resourcetechnology, 2010， 101(23): 9248-9253 ；Arora D S， Gill P K.Product1n ofligninolytic enzymes by Phlebia floridensis.World Journal of Microb1logy andB1technology，2005，21(6-7): 1021-1028)。申请者在前期研究中发现，香菇菌(L.edodes)在发酵油菜秸杆过程中能够利用分泌的锰过氧化物酶(Μηρ)降解木质素，提高油菜秸杆的瘤胃有效降解率和体外有机物质消失率，但同时，发酵过程中产生的纤维素酶也会严重损耗油菜秸杆中的纤维素、半纤维素等瘤胃可利用物质，造成饲料能量的浪费(Zhaoet al.,Effect of fungal treatments of rape straw on chemical composit1n and invitro rumen fermentat1n characteristics.B1resources, 2015， 10(1): 622-637)。如何找到一种只降解木质素而不降解纤维素的方法，是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明利用现代分子技术成功构建了能够在酵母体外表达Μηρ蛋白(Lentinulaedodes mnp2 mRNA for manganese peroxidase, complete cds， GenBank: AB306943.1，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/AB306943.1)的表达载体 pKL-Mnp，利用该载体和乳酸酵母能够制备Μηρ蛋白，进而为Μηρ蛋白在生产中的应用提供技术支撑。
[0005]本发明通过以下技术方案来实现上述
【发明内容】
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一种含有编码香菇锰过氧化物酶(Μηρ)蛋白的酵母表达载体，其特征在于，该载体中含有Μηρ基因，结合乳酸酵母菌可胞外生产Μηρ蛋白。
[0006]本发明还提供该含有编码Μηρ蛋白基因的酵母表达载体的构建方法，其步骤为:
(1)将香燕菌在粉碎的油菜稻杆上固态发酵培养20d，固态发酵水分含量为70% ;固态发酵结束后提取香菇菌丝RNA，利用PCR技术体外扩增香菇Μηρ基因片段；
(2)将Μηρ基因片段连接pMD19-T克隆载体，通过热击法导入大肠杆菌感受态细胞DH5a，转化大肠杆菌构建重组克隆载体pMD-Mnp ；
(3)利用限制性内切酶XhoI和BamH I对重组克隆载体pMD_Mnp进行双酶切，胶回收Μηρ基因片段；
(4)利用与步骤3中相同的限制性内切酶双酶切表达载体PKLAC2;
(5)将步骤3中胶回收的Μηρ基因片段与步骤4中切后的pKLAC2载体连接，通过热击法导入大肠杆菌感受态细胞DH5 α，转化大肠杆菌构建重组表达载体pKL-Mnp，再利用质粒提取试剂盒从重组大肠杆菌中提取表达载体质粒pKL-Mnp。
[0007]本发明还提供一种含有编码Μηρ蛋白基因的酵母表达载体制备Μηρ蛋白的方法，其步骤为，
(1)提取上述重组表达载体pKL-Mnp，利用限制性内切酶SacII对pKL-Mnp载体进行线性化，反应体系为:lOXQuickCut buffer 5 KL，Sac II lKL，质粒8 KL，灭菌水36 ?，30°C孵育 5 min ；
(2)将线性化的pKL-Mnp载体通过电穿孔仪转入商用酵母菌，条件:电压，2.5 kv ;时间，5 ms ;之后再置于含乙酰胺的YCB培养基中培养，筛选含Μηρ基因的重组酵母菌菌落；
(3)将筛选出含Μηρ基因的重组酵母菌菌落加入到YPD液态培养基中，30°C震荡培养3-7 d，Mnp蛋白被分泌到培养液中，含Μηρ基因的重组酵母菌菌液12 h分泌到体外的锰过氧化物酶活性达到56.5 U/Lo
[0008]作为优化，所述含乙酰胺的YCB培养基组成为，30 mmol/L Tris_HCl，l.17%酵母碳源基础，2%琼脂粉，5 mmol/L乙酰胺；
作为优化，所述YPD液态培养基组成为，1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。
[0009]本发明还提供一种含有编码Μηρ蛋白基因的酵母表达载体降解木质素的方法，其步骤为，
(1)取250ml锥形瓶，加入50~100 ml含2~4% (体积百分数)上述已整合Μηρ基因的重组酵母菌菌液的YPD培养基；
(2)再向锥形瓶中加入0.5-1.0 g油菜稻杆；
(3)30°C摇床中震荡培养3~7d，降解了 10~20% (重量百分数)的油菜秸杆木质素。
[0010]利用重组DNA技术可将体外分离到的或合成的目的基因，通过与载体重组连接，导入不含该基因的受体细胞，使受体细胞产生目的基因蛋白。基于香菇菌在发酵油菜秸杆过程产生的Μηρ酶能够有效的降解木质素，本专利旨在构建一种含Μηρ基因的酵母表达载体，以为Μηρ蛋白的商业化生产、以及在油菜秸杆发酵及其他方面中的应用提供理论基础和技术支撑。
[0011]使用本发明的表达载体，可以使酵母菌12 h内分泌到体外的锰过氧化物酶活性达到56.5 U/L，达到甚至超过香菇固态发酵油菜秸杆30 d所分泌的锰过氧化物酶活性。说明本发明成功构建了表达载体pKL-Mnp，并在酵母菌GG799中具有较高的表达活性。本发明核心是针对香菇锰过氧化物酶能够有效降解油菜秸杆木质素，但香菇培养耗时较长且锰酶分泌较低的现实问题，利用现代分子技术将香菇Μηρ基因进行克隆，成功构建表达载体，并结合乳酸酵母菌进行胞外分泌和表达，结果大大缩减了培养时间，提高锰酶的活性。操作简单，便于香燕Μηρ的商业化生产和应用。
【附图说明】
[0012]图1为PCR扩增产物Μηρ电泳图；
图2为重组克隆质粒转化大肠杆菌；
图3克隆质粒pMD-Mnp的PCR电泳图；
图4克隆质粒pMD-Mnp的双酶切电泳；
图5表达质粒pKL-Mnp的PCR电泳图；
图6重组酵母菌的PCR电泳图；
图7重组酵母菌12 h分泌的Μηρ酶活性；
图8重组酵母菌对油菜秸杆木质素和纤维素的降解。
【具体实施方式】
[0013]下面结合附图和实施实例对本发明作进一步详细说明。
[0014]实施例1
菌株、载体、试剂的准备:大肠杆菌感受态细胞DH5a购自天根生化科技(北京)有限公司(CB101-01 );香燕菌(Lentinula edodes 50040)购自中国农业微生物菌种保藏中心。乳酸酵母和表达载体PKLAC2购自NEB公司；真菌总RNA抽提纯化试剂盒(SK8655)、DNA胶回收试剂盒(SK8743)、PCR产物纯化试剂盒(SK8741 )、质粒小提试剂盒(SK8791)购自生工生物工程股份有限公司，cDNA合成试剂盒(6210A)、T4-DNA连接酶(2011A)，Premix Taq (ExTaq Vers1n 2.0)PCR 混合液(RR003A)、限制性内切酶 Xho I (1635BamH I (1605)、SacII (1628)、pMD 19_T克隆载体试剂盒(6013)购自大连宝生物工程公司。
[0015]实施例2
引物设计与合成:根据GeneBank中香燕猛过氧化物酶(Μηρ)的基因序列((Lentinulaedodes mnp2 mRNA for manganese peroxidase, complete cds, GenBank: AB306943.1，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/AB306943.1)，设计引物(F:CGACTCGAGAAAAGAGCGGTTTGTTCTGACGG ；R:TCGGATCCTTAAGAAGTGCAAGTGGCTTC),设计时分别在引物的两端添加限制性内切酶Xho I和BamH I位点；预期扩增的Μηρ片段大小为1079 bp (含酶切位点)。
[0016]实施例3
香菇总RNA的提取:取生长在固体培养基上的香菇菌，接种到含油菜秸杆的培养皿中，生长20 d后取香菇菌丝，根据真菌柱式总RNA试剂盒说明书提取香菇总RNA。
[0017]具体方法如下:
1、取450 yL的Buffer rlysis-FG加入1.5 ml的无RNA酶的离心管中备用。
[0018]2、取25-50 mg新鲜真菌菌丝用液氮研磨成粉末，加入到上述1.5 ml的离心管中，立即震荡混匀，室温放置5 min。
[0019]3、于12000 rpm转速、4 °C下离心3 min，将上清转移至1.5 ml无RNA酶的离心管中。
[0020]4、加入1/2体积的无水乙醇，充分混匀。
[0021]5、将吸附柱放入离心管中，用移液器将溶液全部加至吸附柱中，静置1 min，室温12000 rpm转速下离心1 min，倒掉收集管中废液。
[0022]6、将吸附柱放回离心管中，加入500 yL GT solut1n，静置1 min，室温10000rpm转速离心1 min，倒掉收集管中废液。
[0023]7、将吸附柱放回离心管中，加入500 yL NT solut1n，静置1 min，室温10000rpm转速下离心1 min，倒掉收集管中废液。
[0024]8、将吸附柱放回收集管中，室温12000 rpm转速下离心2 min。
[0025]9、将吸附柱放入无RNA酶的离心管中，在吸附膜中央加入30_50 μ LDEPC-treated ddH20，静置2 min，室温12000 rpm转速下离心2 min，将所得到的RNA溶液置于_70°C保存，以用于后续试验。
[0026]实施例4
RT-PCR扩增Μηρ基因，分两步进行:
1、根据cDNA合成试剂盒进行反转录:Random 6 mers 1 μ 1, dNTP Mixture 1 μ 1, RNA8 yl，65°C保温5 min后，固态碎冰上迅速冷却，加入5*PrimeScript Buffer 4 μ 1,RNase抑制剂0.5 μ l,PrimeScript RTase Ιμ?，水 4.5 μ?，之后 45°C 孵育 45 min，最后 70°C孵育15 min ;
2、RT-PCR扩增:反应体系:Premix EX Taq 25