表达猪细小病毒vp2蛋白的重组载体、重组菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体、重组菌及其应用。
【背景技术】
[0002]猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，尤其是初产母猪在没有免疫的条件下发病更为严重，以死胎、木乃伊胎、死产、母猪流产、延期发情和产弱仔为主要特征。1967年Cartwright首次分离出PPV后，该病毒在世界范围内广泛传播和流行。上世纪80年代我国改革开放以后，随着规模化猪场逐渐增多，PPV在我国的感染越发严重，阳性检出率达90%以上，给我国的养猪产业带来了巨大的经济损失。PPV属于细小病毒科，细小病毒属，PPV基因组编码有3种结构蛋:VP1、VP2和VP3，3种非结构蛋白:NS1、NS2和NS3。其中VP2蛋白是构成PPV病毒衣壳的主要结构蛋白，且是最重要的免疫保护性抗原。
[0003]许多研究和临床实践表明疫苗免疫是控制PPV流行的一个很有效的方法。猪体免疫后，主要通过产生体液免疫应答来获得抵抗PPV感染的保护力。我国用于预防PPV的疫苗主要为灭活疫苗，即将PPV在ST细胞等猪源传代细细胞系上进行培养，分离去除细胞杂质获得具有感染性病毒，之后用化学试剂灭活、佐剂混合制成疫苗。PPV灭活疫苗具有安全性好、不需要低温保存等优点。但灭活疫苗也存在着生产成本昂贵、生产耗时长、需要大量劳动力、且免疫效果不稳定的缺点；另外，灭活的化学试剂和残留病毒DNA可能对免疫猪体存在危险性。新型PPV亚单位疫苗获得了广泛的研究，VP2在体外表达后不仅具有良好的免疫原性，而且可以诱导产生强烈免疫保护性。目前用于研究猪细小病毒亚单位疫苗抗原的表达系统主要是杆状病毒感染的昆虫细胞表达系统，其表达蛋白具有高可溶性和血凝性，能产生病毒样颗粒，免疫保护效果较好，但其生产成本比PPV灭活疫苗高出数倍，在生产操作方面更为复杂，对人员素质要求更高。通常情况下，原核表达系统相比较于真核系统，蛋白表达量高、生产成本低，生产操作更为简单，对人员素质要求也更低，但是现有技术中，采用原核表达系统制备的VP2蛋白为不具有可溶性和血凝性的包涵体，免疫原性较差，免疫后免疫指标不好用通用HI试验进行评定。
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，将该重组载体导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性。
[0005]本发明的另一目的是提供制备猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，可以用于制备猪细小病毒疫苗。
[0006]本发明的再一目的是提供制备猪细小病毒VP2蛋白的方法，该方法能够高效制备VP2蛋白、生产成本低、操作简单，不操作猪细小病毒具有更好的生物安全性。从实际操作性考虑，有望代替灭活疫苗制苗用抗原。
[0007]本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0008]表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，是将猪细小病毒VP2蛋白编码基因插入原核表达载体pEASY-blunt El后得到。
[0009]在本发明中，所述猪细小病毒VP2蛋白编码基因来源于猪细小病毒PPV-JS株。
[0010]本发明还提供表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，是将所述重组载体导入大肠杆菌后获得。
[0011]所述大肠杆菌为BL-21。
[0012]本发明还提供所述重组菌在制备猪细小病毒VP2蛋白方面的应用。
[0013]在本发明中，所述应用包括诱导所述重组菌表达猪细小病毒VP2蛋白的步骤。
[0014]优选的技术方案在，在重组菌培养物0D600达到0.4-0.6时，采用IPTG诱导表达猪细小病毒VP2蛋白。
[0015]优选的技术方案中，IPTG添加至重组菌培养物中的终浓度为0.05-0.2mM。
[0016]本发明表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，有望应用于制备猪细小病毒疫苗。采用本发明重组菌能够高效制备猪细小病毒VP2蛋白，生产成本低、操作简单、不操作猪细小病毒具有更好的生物安全性。
【附图说明】
[0017]图1显示了 VP2蛋白编码基因的扩增结果，其中泳道M为DL 2 000 Marker，其余泳道为PCR扩增产物。
[0018]图2显示了重组质粒P-PPV-VP2的双酶切鉴定结果，其中泳道M为DL 2 000Marker，泳道I为阳性重组质粒p_PPV_VP2。
[0019]图3显示了 VP2蛋白在BL-21-VP2和对照菌BL-21-p中的表达情况。Marker:Thermo Scientific PageRuler 预染Ladder ；1:对照菌BL_21_p裂解液上清；2:BL_21_VP2裂解液上清；3:对照菌BL-21-p裂解液沉淀；4:BL-21-VP2裂解液沉淀。
[0020]
图4是各样品血凝性检测结果，每行左边显示了孔的编号，每行样品从左往右浓度依次降低。
[0021]图5显示了 0D600为0.4、0.5和0.6时诱导后，菌体裂解液上清的血凝性检测结果，其中最左边的标记表明每行样品诱导前的0D600值，右边给出每行样品的血凝效价。
[0022]图6.采用PPV-JS或BL-21-VP2的4单位抗原检测待检血清的HI抗体效价结果，其中左边的文字指出每行检测的血清，右边的文字指出孔的编号。
【具体实施方式】
[0023]实施例1构建表达VP2蛋白的重组菌一构建重组表达载体
1.引物设计
参照PPV- NADL2株基因序列(KF049424.1)，应用Primer premier 5.0软件设计引物PPV-VP2-kpn i和PPV-VP2_bamh i，用于扩增猪细小病毒PPV-JS株(缩写为PPV-JS株，公开于CN102965345A，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCN0.6605) VP2蛋白编码基因全部序列。
[0024]PPV-VP2-kpn i 的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)如下:ggtaccATGAGTGMMTGTGGMCMG，PPV-VP2-bamh i 的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)如下:ggatccCTAGTATMTTTTCTTGGTAT，由上海英骏生物有限公司合成。其中PPV-VP2-kpn i携带Kpn I酶切位点，PPV-VP2_bamh i携带Bamh I酶切位点。
[0025]2.PPV-JS株基因组DNA的提取
(1)取PPV-JS株病毒样品450μ I加入50 μ 1、浓度为10%的SDS溶液，加入3 μ I蛋白酶K ;
(2)在56°C水浴中震荡条件下孵育30min;
(3)加入500μ I的TRIS-酚，混匀，5分钟后，在4°C、10000-12000r/min条件下离心10分钟；
(4)取上清，加入1:1(V/V)混合的TRIS-酚和氯仿混合物500 μ 1，作用5分钟后10000-12000r/min 离心 10 分钟；
(6)取上清，加入500μ I的氯仿，作用5分钟，10000-12000r/min离心10分钟；
(7)取上清，加上清体积2倍的无水乙醇和10%(体积百分浓度)的醋酸钠水溶液；
(8)将步骤(7)所得混合物置于_20°C下30分钟以上；
(9)取_20°C下放置的样品在4°C、10000r/min离心10分钟；
(10)弃上清，在沉淀中加入75%(体积百分浓度)的乙醇水溶液，在4°C、6500r/min离心5分钟，弃去上清；重复2遍；
(11)吸干或者晾干乙醇；
(12)加入30μ I的ddH20溶解，得到PPV-JS株基因组DNA，置于_20°C下保存。
[0026]3.VP2蛋白编码基因的扩增和纯化回收
(I)将反应体系设定为50 yL体系:0.5 μ L PrimerSTAR高保真酶，10 μ L 5XPSBuffer, 4 μ L dNTPs，引物 PPV_VP2_kpn i 和 PPV-VP2_bamh i各 I yL(20 ymol/L),2 yLPPV-JS 株基因组 DNA, 28.5 μ L ddH20。
[0027](2)反应条件:98°C 2min ；98°C 15s，60°C 30 s，72 °C 2min，30 个循环；72°C5min。产物在4°C保存。
[0028](3)采用1%琼脂糖凝胶电泳回收扩增的基因片段，以DL 2 000 Marker作为对照。结果如图1所示，在大约1.7kb处出现特异性的VP2蛋白编码基因条带。采用OMEGA DNA凝胶回收试剂盒回收VP2蛋白编码基因。具体操作见说明书。
[0029]猪细小病毒PPV-JS株VP2蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0030]PCR过程中用到的试剂购自TAKARA。
[0031]4.表达质粒的构建
(I)将VP2蛋白编码基因插入pEASY-blunt El原核表达载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，构建重组质粒P-PPV-VP2。连接体系为5yL体系:2yL VP2蛋白编码基因胶回收产物，I μ L pEASY-blunt El 载体，2 μ L ddH20。24°C连接 20min。
[0032](2)将连接产物加入到100 μ L的DH5a感受态细胞中，冰浴30 min，之后42°C热休克90 S，冰浴5 min。加入ImL LB培养基，37°C摇床上180 rpm培养I h，取出后1000g离心I min，弃800 μ L上清，留200 μ L上清重悬菌体，全部涂布具有氨苄(Amp)抗性的LB平板上，37 °C培养过夜。
[0033](3)随机挑取上述LB平板上的单菌落，接种于具有氨苄抗性的LB液体培养基中，37 °C过夜培养。
[0034]5.质粒的提取
采用鼎国质粒小量提取试剂盒提取本实施例步骤4中挑选到的重组菌内的质粒，具体操作步骤见试剂盒说明书。
[0035]6.重组质粒的鉴定
10 μ L 双酶切鉴定体系:0.5 yL BamH I，0.5 μ L Kpn I，I μ L 1XK Buffer, 4 μ L质粒，4yL ddH20，37°C酶切I h。酶切产物的电泳图如图2所示，质粒经BamH I和Kpn I酶切鉴定正确，为阳性重组质粒，命名为P-PPV-VP2。将重组质粒P-PPV-VP2送英骏公司测序，测序正确。
[0036]二构建重组菌
1.重组质粒