一种菌影载体的构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种菌影载体，所述菌影载体包含锚定基因E’、巴氏杆菌OmpH基因、裂解盒（pBV220-E从阻遏蛋白到终止子的全部序列）和质粒载体pET28a。所述菌影载体中的裂解盒（ci857-E-T1T2）独立存在于pET28a的非多克隆位点区，与pET28a原有的表达系统形成两个独立的表达系统，且方向相反，便于在pET28a的多克隆位点区插入目的蛋白基因，蛋白表达时不会影响目的蛋白的构象，且不易发生通译现象。
【专利说明】一种菌影载体的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种菌影载体的构建方法。
【背景技术】
[0002]菌影是由于噬菌体裂解基因E在革兰氏阴性菌中表达的裂解蛋白使菌体的内外膜出现40nm-200nm的小孔，因渗透压的作用使菌体的内容物溢出而成的细菌空壳。菌影疫苗在制作过程中，受物理和化学因素的破坏因素小，基本保持了免疫原的天然结构，能够作为良好的免疫原对动物起到免疫保护作用。在国外菌影疫苗作为多联苗、多价苗即将进入市场，但在国内，对于菌蜕的研究尤其是作为运输载体的研究还刚刚起步，其中还有很多问题需要我们去研究和探讨。
[0003]菌影作为免疫原直接作用机体，也可作为载体向机体递送蛋白质、核酸以及其他药物，均获得了一定的进展。菌影作为载体递送蛋白质，主要用两种途径实现:(一)将纯化好的蛋白直接浸泡装载到菌影中，添加钙黄绿素可以使膜囊与菌影内膜相融合将菌影缝合起来；(二)利用锚定蛋白将目的蛋白固定靶向细菌内膜上。在现有的重组菌影疫苗中，用于传输外源亚单位蛋白的膜锚定序列主要有:外膜锚定蛋白OmpA (在细胞膜外表达)、胞浆周隙锚定蛋白SbsA (在细胞周质中表达)、内膜锚定蛋白E’(噬菌体PhiX174裂解蛋白E上的第1-54位氨基酸)和L’(在细胞内膜中表达)。
[0004]目前研究者利用锚定蛋白将目的蛋白固定靶向细菌内膜上制备菌影的方法均是将裂解基因E、锚定序列以及目的蛋白串联表达，这对目的蛋白的大小以及空间结构均有要求，且目的蛋白与锚 定序列串联后的空间结构可能会干扰裂解基因E的表达。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种构建菌影载体的新方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种菌影载体，所述菌影载体包含锚定基因E’、巴氏杆菌OmpH基因、pBV220-E载体的表达原件ci857_E_TlT2和质粒载体pET28a。
[0007]进一步地，所述菌影载体为双向表达载体，且两表达系统的方向相反。一种表达系统为pET28a原有的表达系统，可用IPTG诱导表达，用来表达锚定基因与巴氏杆菌OmpH串联基因；另一种表达系统ci857-E-TlT2方向与之相反，通过升温诱导表达裂解基因E，用于制造菌影，两个表达系统独立存在，互不干扰。
[0008]其中，所述巴氏杆菌OmpH基因来自牛巴氏杆菌标准株CVCC393。
[0009]其中，所述pBV220-E载体的表达原件ci857-E-TlT2为pBV220_E载体基因序列中从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列，此序列构成了裂解盒。
[0010]本发明还提供了前述菌影载体的构建方法，包括如下步骤:
[0011]I)以噬菌体PhiX174RFl质粒为模板，PCR扩增裂解基因E，将裂解基因E与T载体连接，筛选阳性质粒；[0012]2)将步骤I)得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220_E ；
[0013]3)以步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的DNA为模板，PCR扩增E’基因；
[0014]4)以巴氏杆菌基因组为模板，PCR扩增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser经overlapPCR将步骤3)得到的E’基因与OmpH基因连接在一起，形成融合片段E’ -OmpH ；
[0015]5)将融合片段E’ -OmpH其插入到质粒载体pET28a多克隆位点区的EcoR1、Sal I位点上，经克隆转化入大肠杆菌BL21 (DE3)或Rossta (DE3)感受态细胞中，酶切鉴定阳性克隆，得到重组表达载体E’ -0mpH-pET28a ；
[0016]6)将步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的ci857_E_TlT2基因序列(从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列)亚克隆到重组表达载体E’ -0mpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位点上，构建双向表达载体E’ -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2。
[0017]构建得到的双向表达载体，通过热激，转入大肠杆菌BL21(DE3)或Rossta (DE3)感受态细胞中，酶切鉴定证明双向表达载体E’ -0mpH-pET28a-ci857-E-TIT2构建成功。经IPTG、42°C迅速升温诱导表达后，SDS-PAGE, westernblot、菌影28°C培养等鉴定，证明成功制备了锚定牛巴氏杆菌OmpH的大肠杆菌菌影。
[0018]本发明还提供了前述菌影载体在大肠杆菌菌影中的应用。
[0019]本发明的有益效果在于:
[0020]本发明所述菌影载体E’ -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2,能够使目的蛋白与菌影独立表达。所述菌影载体中的裂解盒(PBV220-E从阻遏蛋白到终止子的全部序列)独立存在于pET28a的非多克隆位点区，与pET28a原有的表达系统形成2个独立的表达系统，且方向相反，便于在pET28a的多 克隆位点区插入目的蛋白基因，避免了目的蛋白基因对裂解基因E的干扰，蛋白表达时不会影响目的蛋白的构象，且不易发生通译现象。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为菌影载体E’ -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2的构建流程图；
[0022]图2为pBV220-E/DH5 α菌影电镜投射图；
[0023]图3为DH5 α正常大肠杆菌电镜投射图；
[0024]图4为重组融合蛋白表达的SDS-PAGE结果；
[0025]其中:
[0026]M 为蛋白质 Marker ；
[0027]I 为诱导前的重组表达载体 E’ -0mph-pET28a-ci857-E-TlT2/B121 (DE3)；
[0028]2 为重组表达载体 E’ -0mph-pET28a-ci857-E-TlT2/B121 (DE3)先 28°C IPTG 诱导12h 后42°C诱导 2h ；
[0029]3 为 37°C IPTG 诱导 5h 的 E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/B121 (DE3)重组菌；
[0030]4 为 28°C IPTG 诱导 12h 的 E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/B121 (DE3)重组菌；
[0031]5 为 28°C IPTG 诱导 5h 的 E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/B121 (DE3)重组菌。
[0032]6 为 37°C IPTG 诱导 5h E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/Rossta (DE3)重组菌；
[0033]7 为 28°C IPTG 诱导 12h E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/Rossta (DE3)重组菌；
[0034]8 为 28°C IPTG 诱导 5h 的 E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/Rossta (DE3)重组菌；
[0035]图5为重组蛋白E’ -OmpH的Western blot分析；[0036]其中:
[0037]M为蛋白预染marker ；
[0038]I为阴性对照；
[0039]2为重组蛋白E’ -OmpH ；
[0040]图6 (a)为 E’ -0mPH-PET28a-ci857-E_TlT2/BL21IPTG 诱导后四小时切片图；
[0041]图6 (b)为 E’ -0mPH-PET28a-ci857-E-TlT2/BL21IPTG 诱导四小时后升温诱导 2h制成的菌影切片图。
【具体实施方式】
[0042]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0043]实验材料:pBV220 (含有λ pL/pR启动子、阻遏蛋白cI857)本实验室保存。噬菌体PhiX174质粒RFl和pMD18-T:购自大连TAKALA生物公司。E.coli宿主菌BL21 (DE3)、宿主菌Rossta (DE3)、原核表达载体pET28a均为本实验室保存。巴氏杆菌CVCC393购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，限制性内切酶购自美国fermentas公司。
[0044]实施例1以PBV220为载体制备大肠杆菌菌影
[0045]1、E基因的设计与合成
[0046]应用01igo6 .0及primer5.0软件，根据GenBank中登录的噬菌体PhiX174裂解基因E的编码序列(NC-001422)设计引物。在上游引物5'末端引入限制性酶切位点EcoRI，下游5'末端引入限制性酶切位点Sal I限制性酶切位点，两端分别随意加入几个保护性碱基。引物由上海生工合成部门进行合成。
[0047]E 上游引物 El:5’ -CGCGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGT G-3’，下划线内序列为限制性酶切位点EcoRI酶切位点。
[0048]E 下游引物 E2:5' -ACGCGTCGACTCACTCCTTCCGCACG TAAT-3 ’，下划线内序列为限制性酶切位点Sal I酶切位点。
[0049]2、E基因的PCR扩增
[0050]将TAKARA 公司编号为 D3040 噬菌体 PhiX174RF15000r/min 离心 5min ；加入500 μ LddH2O悬浮沉淀；取5 μ L作为PCR扩增模板。
[0051]PCR反应体系见表1:
[0052]表150 μ L PCR反应体系
[0053]
__体积(μΡ_
dNTP ( IOmM)5
上游引物ElUO μΜ)2.5
下游引物Ε2(10μΜ)2.5
PHiX 174 RF 丨质检5
Ex Taq ( 5 u/pL )I
[0054]
【权利要求】
1.一种菌影载体，其特征在于，所述菌影载体包含锚定基因E’、巴氏杆菌OmpH基因、PBV220-E载体的表达原件ci857-E-TlT2和质粒载体pET28a。
2.如权利要求1所述的菌影载体，其特征在于，所述菌影载体为双向表达载体。
3.如权利要求1所述的菌影载体，其特征在于，所述巴氏杆菌OmpH基因来自牛巴氏杆菌标准株CVCC393。
4.如权利要求1所述的菌影载体，其特征在于，所述PBV220-E载体的表达原件ci857-E-TlT2为pBV220_E载体基因序列中从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的菌影载体，其特征在于，所述菌影载体的构建方法包括如下步骤: 1)以噬菌体PhiX174RFl质粒为模板，PCR扩增裂解基因E，将裂解基因E与T载体连接，筛选阳性质粒； 2)将步骤I)得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220-E； 3)以步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的DNA为模板，PCR扩增E’基因； 4)以巴氏杆菌基因组为模板，PCR扩增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser经overlapPCR将步骤3)得到的E’基因与OmpH基因连接在一起，形成融合片段E’ -OmpH ； 5)将融合片段E’-OmpH其插入到质粒载体pET28a多克隆位点区的EcoR1、Sal I位点上，经克隆转化入大肠杆菌BL21或Rossta感受态细胞中，酶切鉴定阳性克隆，得到重组表达载体 E’ -0mpH-pET28a. ； 6)将步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的ci857_E_TlT2基因序列亚克隆到重组表达载体E’ -0mpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位点上，构建双向表达载体E， -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2。
6.权利要求1-5任一项所述的菌影载体的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括如下步骤: 1)以噬菌体PhiX174RFl质粒为模板，PCR扩增裂解基因E，将裂解基因E与T载体连接，筛选阳性质粒； 2)将步骤I)得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220-E； 3)以步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的DNA为模板，PCR扩增E’基因； 4)以巴氏杆菌基因组为模板，PCR扩增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser经overlapPCR将步骤3)得到的E’基因与OmpH基因连接在一起，形成融合片段E’ -OmpH ； 5)将融合片段E’-OmpH其插入到质粒载体pET28a多克隆位点区的EcoR1、Sal I位点上，经克隆转化入大肠杆菌BL21或Rossta感受态细胞中，酶切鉴定阳性克隆，得到重组表达载体 E’ -0mpH-pET28a ； 6)将步骤2)得到的重组质粒pBV220-E的ci857_E_TlT2基因序列亚克隆到重组表达载体E’ -0mpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位点上，构建双向表达载体E， -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2。
7.权利要求1-5任一项所述的菌影载体在大肠杆菌菌影中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103436550SQ201310319778
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月26日 优先权日:2013年7月26日
【发明者】朱战波, 姜东君, 于立权, 崔玉东, 王鹤, 梁宏儒, 赵达, 胡旭, 高佳滨, 陈为宏, 尹辉, 乔波, 陈楠楠 申请人:黑龙江八一农垦大学