一种海参用麦饭石载体噬菌蛭弧菌剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种海参用麦饭石载体噬菌蛭弧菌剂的制备方法，其包括将噬菌蛭弧菌剂与麦饭石按质量比1∶1～4混合；且噬菌蛭弧菌培养液与营养饲料重量比为1∶2～10，其中：噬菌蛭弧菌剂的制备方法包括以下操作步骤：噬菌蛭弧菌增菌、洗涤后收集菌体；菌体与营养饲料混合后干燥，制得噬菌蛭弧菌剂，其与营养饲料混合后制得水份含量为2～5%的终产品，利用本发明实施例所述方法配制的海参用麦饭石载体噬菌蛭弧菌剂，适用于海参的养殖；制备成本低，本发明粉剂保存时间长，无污染。本发明对大批量海参养殖具有重要的现实意义。
【专利说明】一种海参用麦饭石载体噬菌蛭弧菌剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及海产品疾病检测【技术领域】，具体涉及海产品益生菌营养粉，尤其是一种海参用麦饭石载体噬菌蛭弧菌剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]我国海域辽阔，自然条件优越，海洋资源十分丰富。但目前开发利用的程度还很低。这也说明我国开发利用海洋资源的潜力巨大，辽宁海域是中国重要的海洋生物资源、渔业资源宝库，其盛产海参、扇贝、贻贝、牡蛎和鱼、虾以及藻类等，带动海洋经济发展。加强多边和双边的海洋开发国际合作，集中集约开发利用海域及海岛资源，合理配置优势海洋产业，科学高效开发海洋资源，积极开展科研与试验、开发与利用，海水养殖标准化是合理开发海水养殖资源的重要手段，研究制定海产品养殖标准，合理开发海水滩涂养殖资源，提高养殖海产品疾病是当今养殖业的重点内容。
[0003]海产品养殖是一项高风险的养殖业，传统的小户的海产品养殖给养殖户带来了巨大的市场和技术风险。为了将养殖户养殖风险降到最低，开展对各类养殖业，包括鱼、虾、蟹、海参、鲍鱼、贝类、海藻等各类海产品的疾病防治工作任务举足轻重。有报道称，霍乱弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌等有害细菌，是引起海产品各种疾病的罪魁祸首。
[0004]世界海参养殖以刺参(温带种)和糙海参(热带种)为主要品种。除中国、日本、韩国主要养殖刺参外，其他国家均以糙海参为主要养殖对象。近年来，随着自然资源的减少和消费需求的增加，海参的人工养殖在一些国家逐渐兴起。其中，中国和日本是主要的养殖国家，印度、印度尼西亚、越南、菲律宾、韩国、埃及等也有小规模的增养殖。
[0005]刺参(Apostichopus japonicus)是我国有记载的20余种食用海参中价值最高、惟一分布于黄渤海域的温带种。其蛋白质含量高，糖类丰富，脂类含量低，且不含胆固醇，具有很高的营养保健和药用价值，被人们视为重要的海珍品，因而具有重要的市场价值。近年来，海参消费需求量的逐年增加导致了世界范围内海参自然资源的过度开发和种群数量的急剧下降，因此，海参的人工养殖也随之发展起来。随之而来的是海参养殖中遇到的各类问题。
[0006]卩遼菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)是目前最常用的益生菌种类。本发明所述的噬菌蛭弧菌，简称蛭弧菌是一类攻击、侵染、裂解其他微生物的寄生菌，是近些年发展起来的一种微生态制剂，对大多数水产动物病原菌均具有较强的裂解作用，其通过裂解细菌来防止或减少海参病害的发展和蔓延，改善海参体内外环境，促进生长，增强海参免疫力。噬菌蛭弧菌有着天然生物改良剂或天然生物净化因子、生物抗生素或活性抗生素之称。本发明不限定噬菌蛭弧菌的种类，只要是标准菌株即可开发成海参养殖营养制剂，有效提高海参体内的益生菌群。能够达到抗菌、免疫、促生长的多重效果，对海参健康养殖有现实意义。
[0007]麦饭石是一种对生物无毒、无害并具有一定生物活性的复合矿物或药用岩石。麦饭石的主要化学成分是无机的硅铝酸盐。其中包括S1203、Fe203、Fe0、Mg0、Ca0、k20、Na20、Ti02、p205、MnO等还含有动物所需的全部常量元素如K、Na、Ca、Mg、Cu、Mo等微量元素和稀土元素约58种之多。麦饭石是一种天然的药物矿石含有钾、钠、钙、镁、磷常量元素和锌、铁、硒、铜、锶、碘、氟、偏硅酸等十八种微量元素。麦饭石中含铝硅酸盐类长石对色素和细菌有吸附能力。麦饭石能吸附水中游离子，麦饭石经水后可溶出对生物体有用的常量元素K、Ca、Mg 及 S1、Fe、Zn、Cu、Mo、Se、Mn、Sr、N1、V、L1、Co、Cr、1、Ge、Ti 等微量元素和氨基酸。
【发明内容】
[0008]由【背景技术】可见，提高刺参自身的免疫力，增强其抗病力是解决刺参病害问题的重要途径。本研究为达到防治养殖业中海参患病的目的，避免在海参疾病防治中使用抗生素，本发明所述的海参用麦饭石载体噬菌蛭弧菌剂的制备方法，采用以下技术方案实现:包括以下操作步骤:
[0009]噬菌蛭弧菌剂的制备方法包括以下操作步骤:
[0010](I)增菌:从噬菌蛭弧菌标准菌株接种到噬菌蛭弧菌培养基中，27~32°C通气培养12小时后，再以3-5%的体积比接种噬菌蛭弧菌宿主培养基中，进行发酵，27~32°C通气培养24~48小时，至菌悬液菌含量的终浓度为IO7~101(lCfu/g ;制得发酵产物；
[0011](2)洗涤:将步骤(1)获得的发酵产物，以400(T8000rpm转数离心2~5min，以收集菌体；以1:50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌f 5min后，收集混合液；
[0012](3)益生菌配比:将收集的混合液；按1:1的质量比加入大豆粉，再混合均匀；
[0013](4)干燥:上述步骤(3)所得的混合物与营养饲料混合，混合物与营养饲料总重量比为1:2~10，干燥24~36h，产物水份含量为2~5%，制得噬菌蛭弧菌剂；其中:`[0014]所述的营养饲料为:黄粉虫沙50~70份；马尾藻粉:25~40份；海蒿子15~35 ;大豆蛋白10~15份；鱼粉:5~10份；螺旋藻2~5份；贻贝粉2~5份；低聚壳聚糖:1~4份；复合多维I~4份；复合多矿I~4份。
[0015](5)向步骤(4)所得到的芽孢杆菌剂中，按照f 4倍质量，加入麦饭石，充分混合均匀后球磨，球磨条件为:按10-30:1的质量比装入钢球和沉淀物；球磨转速设为35(T450r/min，球磨时间为2~4h，使得终产物的产品粒度为纳米级。
[0016]对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下:所述的噬菌蛭弧菌培养基，其配制方法如下:取4g蛋白胨、Ig酵母粉、Ig氯化钠、IOg葡萄糖、2mg氯化韩，2mg氯化镁溶于100ml水中，105°C灭菌20min ;待所述培养基逐渐冷却后，调节所述溶液的pH至7.5备用。
[0017]对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下:所述的噬菌蛭弧菌培养温度为 30。。。
[0018]对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下:所述的噬菌蛭弧菌宿主菌培养基为大肠杆菌的LB培养液；
[0019]本发明中，上述产品制备方法中，均未限定方法的其他等效条件，因其可根据现有技术确定，也未限定所用试剂的级别，因其对结果影响小，并可以通过配制或商业途径购买获得，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。
[0020]本发明的优点是:适用于海参的育苗池和养成池；处理过程简单，耗时少；制备成 本低于传统方法，本发明粉剂保存时间长，无污染。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022]实施例1
[0023](I)菌种复苏:从噬菌蛭弧菌标准菌株的单一菌落中，挑菌接种到噬菌蛭弧菌培养基中，30°C条件下，培养12h。
[0024](2)增菌:再以4%的体积比接种到噬菌蛭弧菌培养基中，30°C条件下，进行发酵，培养28h，至菌悬液菌含量的终浓度为108cfu/g ;制得发酵产物；
[0025]其中，所述的噬菌蛭弧菌培养基，其配制方法如下:取4g蛋白胨、Ig酵母粉、Ig氯化钠、IOg葡萄糖、2mg氯化韩，2mg氯化镁溶于IOOml水中，105°C灭菌20min ;待所述培养基逐渐冷却后，调节所述溶液的PH至7.5备用。
[0026]所述的噬菌蛭弧菌宿主菌培养基为大肠杆菌的LB培养液；
[0027](3)洗涤:将步骤(2)获得的发酵产物，以5000rpm转数离心3min，以收集菌体；以I: 50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌3min后，收集混合液；
[0028](4)益生菌配比:将收集的混合液；按1:1的质量比加入大豆粉,再混合均匀；
[0029](5)干燥:上述步骤(3)所得的混合物与营养饲料混合，混合物与营养饲料总重量比为1:80，干燥28h，产物水份含量为3%，制得噬菌蛭弧菌剂；
[0030]所述的营养饲料为:黄粉虫沙50份；马尾藻粉:40份；海蒿子35 ;大豆蛋白15份；鱼粉:10份；螺旋藻5份；贻贝粉5份；低聚壳聚糖:4份；复合多维I份；复合多矿4份。
[0031](6)向步骤(5)所得到的芽孢杆菌剂中，按照1:1的质量比，加入麦饭石，充分混合均匀后球磨，球磨条件为:按20:1的质量比装入钢球和沉淀物；球磨转速设为450r/min，球磨时间为3h，使得终产物的产品粒度为微米级。
[0032]实施例2
[0033](I)菌种复苏:从噬菌蛭弧菌标准菌株的单一菌落中，挑菌接种到噬菌蛭弧菌培养基中，30°C条件下，培养12h ；
[0034](2)增菌:再以5%的体积比接种到噬菌蛭弧菌培养基中，30°C条件下，进行发酵，培养48h，至菌悬液菌含量的终浓度为101(lCfu/g ;制得发酵产物；
[0035]其中，所述的噬菌蛭弧菌培养基，其配制方法如下:所述的噬菌蛭弧菌培养基，其配制方法如下:取4g蛋白胨、Ig酵母粉、Ig氯化钠、IOg葡萄糖、2mg氯化韩，2mg氯化镁溶于IOOml水中，105°C灭菌20min ;待所述培养基逐渐冷却后，调节所述溶液的pH至7.5备用。
[0036]所述的噬菌蛭弧菌宿主菌培养基为大肠杆菌的LB培养液；
[0037](3)洗涤:将步骤(2)获得的发酵产物，以5000rpm转数离心3min，以收集菌体；以I: 50的质量比与PBS缓冲液充分混合后，收集混合液；
[0038](4)益生菌配比:将收集的混合液；按1:1的质量比加入大豆粉,再混合均匀；
[0039](5)干燥:上述步骤(3)所得的混合物与营养饲料混合，混合物与营养饲料总重量比为1:70，干燥30h，产物水份含量为5%，制得噬菌蛭弧菌剂；
[0040]所述的营养饲料为:黄粉虫沙60份；马尾藻粉:30份；海蒿子30 ;大豆蛋白15份；鱼粉:7份；螺旋藻4份；贻贝粉4份；低聚壳聚糖:2份；复合多维2份；复合多矿2份。[0041](6)向步骤(5)所得到的芽孢杆菌剂中，按照1:4的质量比，加入麦饭石，充分混合均匀后球磨，球磨条件为:按10:1的质量比装入钢球和沉淀物；球磨转速设为450r/min，球磨时间为4h，使得终产物的产品粒度为纳米级。
[0042]实验例3
[0043]( I)菌种复苏:将噬菌蛭弧菌标准菌株接种到噬菌蛭弧菌培养基中，30°C条件下培养 12h。
[0044](2)增菌:再以5%的体积比接种到噬菌蛭弧菌培养基中，30°C条件下，进行发酵培养28h，至菌悬液菌含量的终浓度为101(lCfu/g ;制得发酵产物；
[0045]其中，所述的噬菌蛭弧菌培养基，其配制方法如下:取4g蛋白胨、Ig酵母粉、Ig氯化钠、IOg葡萄糖、2mg氯化韩，2mg氯化镁溶于IOOml水中，105°C灭菌20min ;待所述培养基逐渐冷却后，调节所述溶液的PH至7.5备用。
[0046]所述的噬菌蛭弧菌宿主菌培养基为大肠杆菌的LB培养液；
[0047](3)洗涤:将步骤(2)获得的发酵产物，以6000rpm转数离心3min，以收集菌体；以I: 50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌5min后，收集混合液；
[0048](4)益生菌配比:将收集的混合液；按1:1的质量比加入大豆粉,再混合均匀；
[0049](5)干燥:上述步骤(3)所得的混合物与营养饲料混合，混合物与营养饲料总重量比为1:60，干燥36h，产物水份含量为5%，制得噬菌蛭弧菌剂；
[0050]所述的营养饲料为:黄粉虫沙50份；马尾藻粉:30份；海蒿子15 ;大豆蛋白15份；鱼粉:8份；螺旋藻5份；贻贝粉4份；低聚壳聚糖:2份；复合多维2份；复合多矿2份。
[0051](6)向步骤(5)所得到的芽孢杆菌剂中，按照1:2的质量比，加入麦饭石，充分混合均匀后球磨，球磨条件为:按10:1的质量比装入钢球和沉淀物；球磨转速设为350r/min，球磨时间为2h，使得终产物的产品粒度为微米级。
[0052]实验例4
[0053](I)菌种复苏:从噬菌蛭弧菌标准菌株的单一菌落中，挑菌接种到噬菌蛭弧菌培养基中，30°C条件下培养12h。
[0054](2)增菌:再以5%的体积比接种到噬菌蛭弧菌培养基中，30°C条件下，进行发酵，培养48h，至菌悬液菌含量的终浓度为101(lCfu/g ;制得发酵产物；
[0055]其中，所述的噬菌蛭弧菌培养基，其配制方法如下:取4g蛋白胨、Ig酵母粉、Ig氯化钠、IOg葡萄糖、2mg氯化韩，2mg氯化镁溶于IOOml水中，105°C灭菌20min ;待所述培养基逐渐冷却后，调节所述溶液的PH至7.5备用。
[0056]所述的噬菌蛭弧菌宿主菌培养基为大肠杆菌的LB培养液；
[0057](3)洗涤:将步骤(2)获得的发酵产物，以4000rpm转数离心5min，以收集菌体；以I: 50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌5min后，收集混合液；
[0058](4)益生菌配比:将收集的混合液；按1:1的质量比加入大豆粉，再混合均匀；
[0059](5)干燥:上述步骤(3)所得的混合物与营养饲料混合，混合物与营养饲料总重量比为1:50，干燥36h，产物水份含量为2%，制得噬菌蛭弧菌剂；
[0060]所述的营养饲料为:黄粉虫沙70份；马尾藻粉:25份；海蒿子35 ;大豆蛋白15份；鱼粉:8份；螺旋藻5份；贻贝粉2份；低聚壳聚糖:4份；复合多维4份；复合多矿4份。
[0061](6)向步骤(5)所得到的芽孢杆菌剂中，按照1:3的质量比，加入麦饭石，充分混合均匀后球磨，球磨条件为:按30:1的质量比装入钢球和沉淀物；球磨转速设为450r/min，球磨时间为4h，使得终产物的产品粒度为纳米级。
[0062]与对照组海参相比，利用本发明实施例f 4所述方法配制的噬菌蛭弧菌剂喂养海参，体重均有所增加，且不易患病；本发明产品适用于海参养殖；处理过程简单，耗时少；制备成本低于传统方法，本发明粉剂保存时间长，无污染。本发明对解决大批量海参的养殖具有重要的现实意义。
[0063]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种海参用麦饭石载体噬菌蛭弧菌剂的制备方法，其特征在于:包括以下操作步骤: 噬菌蛭弧菌剂的制备方法包括以下操作步骤: (1)增菌:从噬菌蛭弧菌标准菌株接种到噬菌蛭弧菌培养基中，27?32°C通气培养12小时后，再以3-5%的体积比接种噬菌蛭弧菌宿主培养基中，进行发酵，27?32°C通气培养24?48小时，至菌悬液菌含量的终浓度为IO7?101(lCfu/g ;制得发酵产物； (2)洗涤:将步骤(I)获得的发酵产物，以400(T8000rpm转数离心2?5min，以收集菌体；以1:50的质量比与PBS缓冲液混合，充分搅拌f 5min后，收集混合液； (3)益生菌配比:将收集的混合液；按1:1的质量比加入大豆粉，再混合均匀； (4)干燥:上述步骤(3)所得的混合物与营养饲料混合，混合物与营养饲料总重量比为1:2?10，干燥24?36h，产物水份含量为2?5%，制得噬菌蛭弧菌剂；其中: 所述的营养饲料为:黄粉虫沙50?70份；马尾藻粉:25?40份；海蒿子15?35 ;大豆蛋白10?15份；鱼粉:5?10份；螺旋藻2?5份；贻贝粉2?5份；低聚壳聚糖:1?4份；复合多维I?4份；复合多矿I?4份； (5)向步骤(4)所得到的芽孢杆菌剂中，按照f4倍质量，加入麦饭石，充分混合均匀后球磨，球磨条件为:按10?30:1的质量比装入钢球和沉淀物；球磨转速设为35(T450r/min，球磨时间为2?4h，使得终产物的产品粒度为纳米级。
2.根据权利要求1所述的海参用麦饭石载体噬菌蛭弧菌剂的制备方法，其特征在于，所述的曬菌蛭弧菌培养基，其配制方法如下:取4g蛋白胨、Ig酵母粉、Ig氯化钠、IOg葡萄糖、2mg氯化钙，2mg氯化镁溶于IOOml水中，105°C灭菌20min ;待所述培养基逐渐冷却后，调节所述溶液的PH至7.5备用。
3.根据权利要求2所述的海参用麦饭石载体噬菌蛭弧菌剂的制备方法，其特征在于，所述的噬菌蛭弧菌培养温度为30°C。
【文档编号】A23K1/16GK103815158SQ201210466001
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年11月16日 优先权日:2012年11月16日
【发明者】谢克焕 申请人:大连德通生物技术开发有限公司