专利名称：蛭弧菌蛭质体菌液在海参育苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌的应用，特别涉及蛭弧菌蛭质体在海参 育苗中的应用。
背景技术：
海参，学名仿刺参(Apostichopus japonicus)，属棘皮动物门，海参纲，楣手目。在 我国主要分布在在辽宁、河北、山东和江苏省近海。海参名列“八珍”之中。近年来我国的 海参养殖一直受到苗种质量的制约。具体表现为人工育苗病害频发、育苗产量不稳定、幼苗 阶段发生“烂胃” “烂边”等病害，病害严重时可导致90%以上死亡。因此，极有必要研发一 种提高海参育苗成活率、增强其免疫力的无公害育苗新方法。蛭弧菌是寄生于其他细菌，并能导致宿主细菌裂解的一类细菌；比一般细菌小，能 通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用；革兰氏染色呈阴性，可以裂解致病或潜在致病性细 菌。蛭弧菌的生活史可分为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体状态和在宿 主细菌内生长发育的蛭质体状态。游泳体蛭弧菌侵入宿主的周质空间的同时失去鞭毛，宿 主细胞外膜出现一个孔隙供蛭弧菌入侵，当蛭弧菌侵入到宿主体内时，孔隙重新封闭，宿主 细胞即成为"蛭质体"。与游泳体相比，蛭质体不仅具有制备、保存更为方便，环境耐受力 强，作用时间虽略慢但更久的特点，同时还具有潜在的灭活疫苗功能。当游泳体蛭弧菌入 侵宿主细胞后，宿主细胞的呼吸作用(respiration)很快被停止。蛭弧菌也进入蛭质体状 态，开始分泌多种酶，消解宿主细胞的大分子为小分子物质，进而整合为自身的营养物质， 使自身生长，变长。最终，长条状的蛭质体分成很多短的节段，长出鞭毛，重新成为游泳体。 之后，它们分泌必需的酶类，破壁而出，再次成为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳 体。在此蛭质体发育期间，蛭弧菌并不改变宿主细胞的表面结构，使原宿主仍具有免疫原 性，可刺激生物体，产生免疫应答反应。这一潜在功能使得应用蛭弧菌蛭质体于海参育苗 中，可有效预防参苗细菌病的产生，提高育苗成活率。另外，本发明中育苗方法采用周期全池换水，如此不仅减少养殖用水量和废水排 放，更减少能耗，降低养殖成本；和倒池换水、封闭循环养殖等方法相比，投入少，易推广。因 此，该方法是一种便利可行、绿色、低碳、节能环保的育苗方式。
发明内容
本发明的首要目的在于克服已有方法的不足，提供蛭弧菌蛭质体在海参育苗中的 应用方法，其特征按照养殖生态学原理，海洋生物的生长环境要求，生物之间的相互关系及 无公害养殖标准，人工创造养殖环境，减少投入成本，提高海参育苗成活率，增强免疫力，提 高经济效益。本发明的目的通过下述方案实现蛭弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用。
所述蛭弧菌蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp. Strain)BDMOl于2008年4月沘 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO M 208066。所述蛭弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用是将饲料在蛭弧菌蛭质体菌液中浸 泡 15-45min。所述蛭弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用是在水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液， 使水体中蛭弧菌蛭质体浓度为IO1 l(fpfu/mL。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果1、蛭弧菌蛭质体对致病或潜在致病菌有强的裂解力，而且也能改善养殖生物肠道 环境，促进生长。因此，与现有海参育苗方法相比，本发明具有提高海参育苗成活率，增强免 疫力，提高抗病能力，净化水质，最长可达到20天不换水，降低生产成本，提高经济效益的 效果。2、本发明所述蛭弧菌蛭质体在海参育苗的应用中安全性好，现有的研究表明蛭弧 菌对海参无毒性作用，对人类无致病性。3、本发明所述蛭弧菌蛭质体因具有潜在灭活疫苗功能，可刺激参苗产生免疫应答 反应，有效预防参苗细菌病的产生，大大提高育亩成活率。
具体实施例方式下面结合实施例及表格对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。实施例1蛭弧菌蛭质体菌液制备在含有副溶血弧菌(接种浓度为IO7CfVmL的菌 ImL) (Vibrio parahaemolyticus,购于美国典型物种保藏中心 AmericanType Culture Collection, ATCC 17802)的 IL DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤 0.88，酪蛋白酸水解物0.58，酵母精提物0. lg，溶于IOOOmL蒸馏水中，pH值为7. 5)中， 接入ImL浓度为l(fpfu/mL蛭弧菌BDM01，恒温摇床培养、250rpm培养48h，培养液经 4 V 6000rpm离心15min后，去除上清，沉淀即得蛭质体，沉淀用IOOmL DNB液体培养基悬浮， 得到浓度为lOYfu/mL的蛭弧菌BDM01蛭质体菌液。实施地点山东某海参养殖场，育苗种类仿刺参(Apostichopusjaponicus)海参育苗具体包括亲参采捕，亲参蓄养，产卵孵化与幼体培育，采苗和稚参培育， 蛭弧菌蛭质体在海参育苗中的应用，其方法具体如下育苗设施与水质条件主要包括沉淀滤水设施、增氧设施、育苗室和饵料室。海水水源符合国家渔业水 质标准(GB11607-89)要求。育苗用水经二级过滤系统沉淀，再经入池管道口 300目筛绢 网滤出，经镜检无大型原生动物入池。每个海参育苗池为20m3，池形为长条状，长宽之比为 3 I0亲参采捕以自然海区采捕的刺参为好。采捕时间海水底层水温达到15.6°C时，亲参产卵 前6天集中采捕。选择平均体长20cm，平均体重250g、平均性腺指数10%、无损伤的个体作为亲参。亲参蓄养蓄养密度25只/m3，蓄养的水温16. 8°C，蓄养时间5天，在蓄养池中进行。蓄养池 中的水经过精细过滤。在水中加入蛭弧菌蛭质体菌液，使培育池中的蛭弧菌蛭质体终浓度 达到lO^KfUO^Kfpfu/mL。短期蓄养过程不投饵，不换水，每天早晚利用虹吸作用清理池 中的粪便等污物。投饵前，所有饵料要用浓度为Io1UO3UO5UOYfuAiL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡 30mino此外还需每日清晨吸底检查是否有卵，以免漏掉，如仅见少量产卵可弃掉。产卵孵化与幼体培育受精采用混合受精方式。为保证受精质量，防止精液过多，及时将过多的雄参(已 见排精的个体)挑出并移入另外的水池中。亲参产卵受精后及时将亲参移出，并用过滤海 水洗卵十次，使池水变清，再向各池中加入蛭弧菌游泳体菌液，使其终浓度分别为10\103、 105、l(fpfu/mL，受精卵直接在蓄养池中孵化。受精卵的孵化密度控制在8个/mL，适宜孵化水温为20 25°C，孵化期间每隔 0. 用搅水耙将池水上、下翻动一次，翻水时应不留死角且不能向一个方向旋转，以避免 将胚体旋向池中心聚集。胚体孵出后，必要时可给予微充气。初耳幼体产生后，稀疏、分池进行幼体培育。培育池中的海水为经砂滤的海水，向 池中加入蛭弧菌游泳体菌液，使其终浓度分别为IO1UO3UO5UO7PfuAiL,幼体布池密度为 0.6个/mL。孵化48小时后，即可投饵。饵料主要为天然的藻类，牟氏角毛藻。藻类的日投 饵量在初耳幼体期为1. 5万/mL，中耳幼体期为2. 5万/mL，大耳幼体期为4. 5万/mL，每日 分3次投喂。所有投喂的饵料需事先用浓度为IO1UO3UO5UO7PfVmL的蛭弧菌蛭质体菌液 浸泡30min。所用水质符合农业部《无公害食品海水养殖用水水质》(NY5052-2001)的要求，幼 体培育期间全部使用二级砂滤水。本阶段仅5天，不需换水、倒池，但仍要密切观察水质及 时利用虹吸作用或吸底器清除池底污物采苗当樽形幼体出现的比例占整个幼体的15%时开始采苗。采苗器为聚乙烯波纹板， 投放量为60片/m3。用16mg/L的高锰酸钾溶液洗刷，最后用过滤海水冲洗干净。将洗刷干 净的采苗器放入饵料池中自然地接种海水中的底栖硅藻，以菱形藻为主，15天后，在采苗器 的附着基上附着一层天然的底栖硅藻，即可投放使用。使用前要用水冲去污物，放入浓度为 107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液中浸泡30min。每平方米投放80片，呈60°或45°角斜放， 以便投饵时承接饵料。稚参培育附苗密度2个/cm2，稚参密度过大则成活率降低。体长小于2mm稚参，投喂天然 的单细胞藻角毛藻，日投喂量控制在35g/m3，随着稚参的生长，要及时补充新的天然的单胞 藻。当体长达到2mm时，可完全以鼠尾藻磨碎液为饵料，每日投喂5次，每次用量30g/m3。投 放的所有饵料均需要放入浓度为l(fpfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液中浸泡30min。稚参经培育40天，长成规格为3 5mm的稚参，可筛选转移到40目或60目的附着基上。实施例2工厂生产的育苗方式，视池塘水质情况进行换水，稚参培育期加大换水量，日换水 量为3个全量，并5天倒池一次。实施例3在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，其制备过程同实施例1。实施例3. 1在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO1Pfu/ mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每5天(全池)换水一次，换水后重新加菌。实施例3. 2在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO1Pfu/ mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每10天(全池)换水一次，换水后重新加菌。实施例3. 3在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO1Pfu/ mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每15天(全池)换水一次，换水后重新加菌。实施例3. 4在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO1Pfu/ mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每20天(全池)换水一次，换水后重新加菌。实施例3. 5在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO3Pfu/ mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每5天(全池)换水一次，换水后重新加菌。实施例3. 6在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO3Pfu/ mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每10天(全池)换水一次，换水后重新加菌。实施例3. 7在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO3Pfu/ mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每15天(全池)换水一次，换水后重新加菌。实施例3. 8在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO3Pfu/ mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每20天(全池)换水一次，换水后重新加菌。
实施例3. 9在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO5Pfu/ mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每5天(全池)换水一次，换水后重新加菌。实施例3. 10在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 105pfu/mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每10天(全池)换水一次，换水后重新 加菌。实施例3. 11在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 105pfu/mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每15天(全池)换水一次，换水后重新 加菌。实施例3. 12在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 105pfu/mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每20天(全池)换水一次，换水后重新 加菌。实施例3. 13在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 107pfu/mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每5天(全池)换水一次，换水后重新加菌。实施例3. 14在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 107pfu/mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每10天(全池)换水一次，换水后重新 加菌。
实施例3. 15在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 l(fpfu/mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每15天(全池)换水一次，换水后重新 加菌。实施例3. 16在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 107pfu/mL，投放天然的单细胞藻角毛藻作为饵料，每20天(全池)换水一次，换水后重新 加菌。实施例4投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡后的天然的单细胞藻角毛藻，其余同实施例1。实施例4. 1投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到IO1PfuAiL,每5天(全池)换水一次。实施例4. 2投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到IO1PfuAiL,每10天(全池)换水一次。实施例4. 3投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到IO1PfuAiL,每15天(全池)换水一次。实施例4. 4投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到IO1PfuAiL,每20天(全池)换水一次。实施例4. 5投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到l(fpfu/mL，每5天(全池)换水一次。实施例4. 6投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到l(fpfu/mL，每10天(全池)换水一次。实施例4. 7投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到l(fpfu/mL，每15天(全池)换水一次。实施例4. 8投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到l(fpfu/mL，每20天(全池)换水一次。实施例4. 9投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到105pfu/mL，每5天(全池)换水一次。实施例4. 10投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到105pfu/mL，每10天(全池)换水一次。实施例4. 11投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到105pfu/mL，每15天(全池)换水一次。实施例4. 12投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到105pfu/mL，每20天(全池)换水一次。实施例4. 13投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到l(fpfu/mL，每5天(全池)换水一次。实施例4. 14投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到l(fpfu/mL，每10天(全池)换水一次。实施例4. 15投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液 中蛭质体菌体浓度达到l(fpfu/mL，每15天(全池)换水一次。实施例4. 16投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到l(fpfu/mL，每20天(全池)换水一次。实施例5在水中加入蛭弧菌蛭质体菌液，同时投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡后的天然的单细 胞藻角毛藻，其余同实施例1。实施例5. 1在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO1Pfu/ mL，每5天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天 然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到IO1PfuAiL,投放饵料。实施例5. 2在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO1Pfu/ mL，每10天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天 然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到lObfu/mL。
实施例5. 3在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO1Pfu/ mL,每15天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天 然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到lObfu/mL。实施例5. 4在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO1Pfu/ mL，每20天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天 然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到lObfu/mL。实施例5. 5在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO3Pfu/ mL，每5天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天 然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到103pfu/mL。实施例5. 6在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO3Pfu/ mL，每10天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天 然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到103pfu/mL。实施例5. 7在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO3Pfu/ mL,每15天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天 然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到103pfu/mL。实施例5. 8在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到IO3Pfu/ mL，每20天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天 然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到103pfu/mL。实施例5. 9在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 105pfu/mL,每5天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min 后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到105pfu/mL。实施例5. 10在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 105pfu/mL,每10天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min 后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到105pfu/mL。实施例5. 11在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 105pfu/mL,每15天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min 后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到105pfu/mL。实施例5. 12在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 105pfu/mL,每20天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到105pfu/mL。实施例5. 13在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 107pfu/mL,每5天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min 后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到107pfu/mL。实施例5. 14在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 107pfu/mL,每10天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min 后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到107pfu/mL。实施例5. 15在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 107pfu/mL,每15天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min 后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到107pfu/mL。实施例5. 16在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度达到 107pfu/mL,每20天(全池)换水一次，换水后重新加菌，投喂蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min 后的天然的单细胞藻角毛藻，菌液中蛭质体菌体浓度达到107pfu/mL。生长指标测定方法如下成活率(%) = Nt/NoX100% ；式中N。为试验开始时入池幼体数；Nt为试验结束时出池幼参数；免疫指标测定方 法如下酸性磷酸酶(ACP)与碱性磷酸酶(AKP)活力的测定制备粗酶提取液。取各试验和对照组的海参幼苗(规格3 5mm) 10头，用冰冻 双蒸水G°C，pH 7.0)冲洗干净，用吸水纸吸干水分后，准确称取组织质量，按质量体积比 1 9加入0.86%的冷生理盐水，在液氮中研磨成勻浆状，分装于1.5mL的离心管中，4°C， 12000r/min离心lOmin，取上清液，加入9倍体积冷生理盐水，制成粗酶提取液。4°C保存， 并于Mh内分析完毕。碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性均采用Kruzel (1982)磷酸苯二钠法， 以每克组织蛋白在37°C与磷酸苯二钠分别作用15min和30min，产生Img酚为一个酶活力单位。五、水质检测1、氨态氮用次溴酸纳氧化法测定(GB12763. 4-91)；2、亚硝酸盐氮用重氮-偶氮光度法测定(GB12763. 4-91)3、用对二甲氨基苯胺分光光度法测定(GB16489-1996)经过测定，实施例2水池中的各项水质测定值均高于试验组实施例3、实施 例4、实施例5的。其中，实施例2氨态氮的检测结果为0. 506mg/L，高于实施例3的 0. 431-0. 456mg/L,实施例 4 的 0. 467-0. 492mg/L,实施例 5 的 0. 403-0. 441mg/L ；实施 例2亚硝酸盐氮检测结果为0. 015mg/L,高于实施例3的0. 008-0. 009mg/L,实施例4的 0. 011-0. 013mg/L,实施例5的0. 007-0. 008mg/L ；实施例2H2S检测结果为0. 2mg/L,高于实 施例 3 的 0. 056-0. 137mg/L,实施例 4 的的 0. 114-0. 179mg/L,实施例 5 的 0. 024-0. 106mg/ L ；由以上结果分析可知，应用浓度为IO1-KfpfuAiL蛭弧菌蛭质体可有效改善养殖水体环 境，调节水中氨态氮、亚硝酸盐氮、H2S的含量，从而提供有利于参苗生存的水体环境，并且 同时在水体和饲料中添加蛭弧菌蛭质体的效果最佳。
六、细菌数测定1、菌落总数用营养琼脂培养基检测(GB4789. 2-2010)2、弧菌总数用TCBS培养基检测(SN/T 0173-2010)3、pH用PHB-3便携式pH计测定实施例2的总细菌数和总弧菌数分别高达4. 63X 103cfu/mLW和6. 09X 102cfu/ mL。实施例3、实施例4、实施例5的总细菌数分别为4. 15X 102cfu/mL、4. 34X 102cfu/mL、 4. 21X102cfu/mL ；总弧菌数 8. 2X 10cfu/mL、7. 8X 10cfu/mL、6. 6X 10cfu/mL，与实施例 2 比明显都降低了 1个数量级。各组的PH都在7. 5-9之间，变化不大。说明蛭弧菌蛭质体能有效控制水体的细菌数，改善水质。综合来看，添加蛭弧菌蛭 质体，能明显的提高参苗成活，增强对参苗的免疫力，而且可改善水质，达到节水节能、提高 成活率的良好效果。同时，由实验数据可知，无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体 菌液浓度为IO1-KfpfuAiL,或者是在饲料中添加浓度为IO1-KfpfuAiL蛭弧菌蛭质体菌液， 或是两者兼用，虽长达30天不换水，但也可促进对虾成活，增强免疫力，提高育苗期抗病能 力，并且在水体和饲料中同时添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最好。七、感染实验感染试验于预先消毒的盛有IOOL砂滤海水的透明水族箱中进行，水中加入副溶 血弧菌(Vibrio parahaemolyticus购于美国典型物种保藏中心American Type Culture Collection, ATCC 17802)，使水体中副溶血弧菌终浓度为108cfu/mL。每个实施例随机 取海参苗60头，平均分成两组，设两个平行。另一组正常培育。试验水温保持在20°C， 充气培养。人工感染后，连续观察10天，最终计算成活率，采用相对存活率(Relative PercentageSurvival, RPS)计算式RPS (% ) = (1-免疫组死亡率/对照组死亡率)X 100%六、实验结果由表1可知，成活率实施例3、实施例4、实施例5成活率均高于实施例2，增加值 分别彡20. 24%, 18. 75%, 32. 77%。ACP 实施例3、实施例4、实施例5比实施例2增加值 分别彡0. 025U/mL,0. 024U/mL，0. 026U/mL。AKP 实施例3、实施例4、实施例5比实施例2 增加值分别彡0. 027U/mL,0. 029U/mL,0. 041U/mL。感染实验的结果显示实施例3、实施例 4、实施例5成活率均高于实施例2，增加值分别> 75. 32%,72. 34%,85. 64%。说明实施例 3、实施例4、实施例5组的参苗对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有强效的免疫 抵抗力。由以上数据分析可知，检测项数据随着蛭弧菌蛭质体浓度的增加而增加，但换水 周期对其的影响不显著。因此，在实际生产中，换水周期可设为20天一次。如此，既可降低 能耗和劳动力，又可减少排污，保护环境。因此，无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌液浓度为 IO1-KfpfuAiL,或者是在饵料用浓度为IO1-IO7PfuAiL蛭弧菌蛭质体菌液浸泡，或者同时在 水体和饵料中添加蛭弧菌蛭质体菌液，虽长达20天不换水，但也可促进海参育苗成活，增 强免疫力，提高育苗期抗病能力，并且在水体和饵料中同时添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最 好。
表1稚参各项指标测定结果
权利要求
1.蛭弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用。
2.根据权利要求1所述蛭弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用，其特征在于所述蛭 弧菌蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDMOl于2008年4月观日保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M208066。
3.根据权利要求1所述蛭弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用，其特征在于所述蛭 弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用是将饲料在蛭弧菌蛭质体菌液中浸泡15-45min。
4.根据权利要求1所述蛭弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用，其特征在于所述蛭 弧菌蛭质体菌液在海参养殖中的应用是在水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭弧菌 蛭质体浓度为101 107pfu/mL。
全文摘要
本发明公开了蛭弧菌蛭质体在海参育苗中的应用，通过在水体和饵料中添加蛭弧菌蛭质体实现，在水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体浓度为101-107pfu/mL，同时饵料要用浓度为101～107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min，养殖期间可达到20天不换水。本发明为生物养殖方法，绿色、安全、无污染，效果显著，能够改善水质，高海参育苗成活率，增强免疫力，提高育苗期抗病能力，有极好的发展前景。对提高经济效益和食用安全性，保障人类健康具有十分重要的意义。
文档编号A23K1/16GK102037916SQ20101026859
公开日2011年5月4日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者王沛贤, 蔡俊鹏 申请人:华南理工大学