用于检测哈维弧菌群的基因芯片及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测海洋致病菌的基因芯片，尤其是涉及用于检测哈维弧菌群的基因 芯片及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 哈维弧菌群是弧菌属的核心类群，是引起海水养殖鱼虾贝类病害发生的最常见病 原菌，包括溶藻弧菌（mio 坎氏弧菌（K 哈维弧菌（K AarKeja·)、需钠弧菌（Kirie供、副溶血弧菌（K 和轮虫弧菌（K roii/kriafflAs·)。哈维弧菌群不但能经常引起水产养殖病害的暴发，给水产养殖业造成巨大 经济损失；同时也能通过接触海水、生食海鲜或进食被该菌污染的食物而引起人类疾病。哈 维弧菌群具有高度相似的表型和基因型，无法在种水平上进行快速准确的鉴定。因此，在种 水平上快速鉴定弧菌病原菌对于及早采取针对性防治措施，减轻病害损失具有重要意义。 细菌16SrRNA基因常被用于细菌的种属鉴定，但哈维弧菌群各种的基因组内16SrRNA基 因是多拷贝的，通常在8-14个之间；而且，基因组内不同拷贝16SrRNA基因的差别会大于 种间差别，给种的鉴定带来极大混乱。
[0003] 基因芯片技术基本原理是在固相支持物上固定核酸，通过杂交过程来检测样品中 靶基因序列的存在，并通过检测荧光信号达到半定量的目的。该技术具有高度的并行性、多 样性和特异性等特点，是高效、快速、大规模获取相关生物信息的重要手段。利用该技术可 以在数分钟至几小时内完成传统生物学方法(包括分子生物学方法）数周、数月甚至数年才 能完成的工作量。
[0004] 现有的基因芯片及其专利技术报道中，如"一种可并行检测多种弧菌的基因芯片 及其监测方法"（发明专利，CN103451310A，2013)和"一种用于检测海产品中九种致病性弧 菌的基因芯片"（发明专利，CN103820558A，2014)，虽然也报道了利用基因芯片技术检测弧 菌，但是这类发明专利中所设计的探针多是针对16SrRNA基因和hsp60基因，而这类探针 并不能有效用于表型和基因型都高度相似，且无法在种水平上进行快速准确鉴定的哈维弧 菌群。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能并行性的快速高效检测病原哈维弧菌 群的6种致病弧菌，且准确性和灵敏度高、特异性强的用于检测海水中哈维弧菌群的基因 芯片及其使用方法。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测哈维弧菌群的基因 芯片，包括芯片载体，其特征在于：所述的芯片载体上固载有用于检测溶藻弧菌、坎氏弧菌、 哈维氏弧菌、需钠弧菌、副溶血弧菌和轮虫弧菌的核苷酸探针，所述的用于检测溶藻弧菌的 探针、所述的用于检测坎氏弧菌的探针、所述的用于检测哈维氏弧菌的探针、所述的用于检 测需钠弧菌的探针、所述的用于检测副溶血弧菌的探针和所述的用于检测轮虫弧菌的探针 均使用基因为靶基因，其中，溶藻弧菌有4条探针覆盖整个种，分别用2条探针覆盖种 内2个明显差异的聚类分支。各探针的基因序列如下：
[0007] -种用于检测哈维弧菌群的基因芯片的使用方法，包括待测哈维弧菌群待测样品 DNA提取步骤；样品PCR扩增步骤；PCR产物与芯片杂交步骤，芯片杂交后的处理，杂交芯片 的扫描及结果判读的步骤，其特征在于：所述的样品PCR扩增步骤中针对哈维弧菌群不同 菌种的基因所设计的PCR扩增的正向引物和带地高辛标记的反向引物的基因序列如 下：
[0008] 所述的样品PCR扩增步骤中扩增体系为：无菌水5. 3yL;10XPCR缓冲液1.5 yL;2. 5mMdNTP混合物1yL;10μΜ正向引物各0. 5yL;10μΜ反向引物各0. 5 yL;样品DNA1yL;5U/yLrTaq酶 0· 2yL;扩增程序为：94°C4min;94°C30s; 56°C30s;72°C30s;35 个循环；72°C4min。
[0009]与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明利用哈维群弧菌细胞内的单拷贝保 守基因tox对故为靶标，通过设计针对溶藻弧菌、坎氏弧菌、哈维弧菌、需钠弧菌、副溶血弧 菌和轮虫弧菌的探针，制作可用于哈维菌群快速鉴定的基因芯片，采用多重PCR技术同时 扩增6个弧菌的基因，在基因芯片上平行、快速地鉴定哈维弧菌群。所设计的基因芯片 能并行性的快速高效检测病原哈维弧菌群的6种致病弧菌，并且具有更加特异和灵敏的特 点。此外，基因芯片的探针设计通过分析数据库中所有的哈维弧菌群基因序列，设计 哈维弧菌群种特异性探针，显著提高了检测的特异性。本发明不但填补了利用基因芯片同 时检测哈维弧菌群6个相似种的技术空白，更提高了这种海水养殖致病菌群的鉴别能力， 极大缩短了检测的时间。
[0010] 综上所述，本发明用于检测哈维弧菌群的基因芯片可达到检测哈维弧菌群的目 的，具有快速、准确、操作简便和重复性强等优点，成果的应用可指导海水养殖病害机理的 研究以及相应防治手段的快速应用，降低病害损失。
【附图说明】
[0011] 图1为基因芯片上各探针位置； 图2为溶藻弧菌ATCC17749τ特异性探针基因芯片验证结果图； 图3为溶藻弧菌NBV00022特异性探针基因芯片验证结果图； 图4为坎氏弧菌MCCC1Η0050Τ特异性引物基因芯片验证结果图； 图5为哈维弧菌MCCC1Η0031Τ特异性探针基因芯片验证结果图； 图6为是需钠弧菌MCCC1Η0025Τ特异性探针基因芯片验证结果图； 图7为副溶血弧菌MCCC1Α02609Τ特异性探针基因芯片验证结果图； 图8为轮虫弧菌CA頂577τ特异性探针基因芯片验证结果图； 图9为溶藻弧菌（ATCC17749τ)的基因芯片检测结果图； 图10为溶藻弧菌（NBV00022)的基因芯片检测结果图； 图11为坎氏弧菌（MCCC1Η0050Τ)的基因芯片检测结果图； 图12为哈维弧菌（MCCC1Η0031Τ)的基因芯片检测结果图； 图13为需钠弧菌（MCCC1Η0025Τ)的基因芯片检测结果图； 图14为副溶血弧菌（MCCC1Α02609Τ)的基因芯片检测结果图； 图15为轮虫弧菌（CA頂577τ)的基因芯片检测结果图； 图16为溶藻弧菌（ATCC17749τ)、溶藻弧菌（NBV00022)、坎氏弧菌（MCCC1Η0050Τ)、哈 维弧菌（MCCC1Η0031Τ)、需钠弧菌（MCCC1Η0025Τ)、副溶血弧菌（MCCC1Α02609Τ)和轮虫弧 菌（CA頂577τ)混合模版基因芯片检测结果图； 图17为溶藻弧菌（ATCC17749τ )、坎氏弧菌（MCCC1Η0050Τ)、哈维弧菌（MCCC1H0031T)、需钠弧菌（MCCC1H0025T)、副溶血弧菌（MCCC1A02609T)和轮虫弧菌（CAIM577τ) 混合模版检测结果； 图18为溶藻弧菌（ATCC17749τ)、溶藻弧菌（NBV00022)、坎氏弧菌（MCCC1Η0050Τ)、哈 维弧菌（MCCC1Η0031Τ)、需钠弧菌（MCCC1Η0025Τ)和轮虫弧菌（CA頂577Τ)混合模版基因 芯片检测结果图； 图19为病原菌（XBF1001)的基因芯片检测结果图； 图20为病原菌（XBF1002)的基因芯片检测结果图； 图21为病原菌（XBF0906)的基因芯片检测结果图； 图22为病原菌（XBF1004)的基因芯片检测结果图。
【具体实施方式】
[0012] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0013] 具体实施例一 探针的制备 1、目标检测菌种及靶基因 本发明选择海水养殖动物中重要的常见病原菌-哈维弧菌群作为检测对象，包括溶藻 弧菌、坎氏弧菌、哈维氏弧菌、需钠弧菌、副溶血弧菌、轮虫弧菌，各菌种均使用基因为 靶基因。
[0014] 2、探针设计 本发明采用18 - 30bp的寡核苷酸探针。探针参数基本要求是特异性和高效的杂交， 探针TJ直保持相近，在上下10°C范围内浮动；形成二聚体和发夹结构的连续互补碱基数少 于4个(值小于4. 5kcal/mol);探针与非目标基因序列的连续匹配碱基数少于7个碱基； 探针与目标基因的错配碱基数少于4个碱基。验证后的探针在5'端上加上16个T尾巴， 以减少DNA杂交时的空间位阻，提高杂交效率。同时在探针5'端进行氨基修饰，与玻片上 的醛基交联，将探针固定在玻片上。
[0015] 本发明针对不同菌种的如冰基因共设计14条探针，在探针的5'端带有16个 P〇ly-T和氨基修饰(见表1所示)。每一种菌至少设计2条不同的探针，而溶藻弧菌有4条 探针分别检测溶藻弧菌在进化树上的两个不同亚种，每个亚种有2条不同的探针。
[0016] 表1探针信息表
[0017] 具体实施例二 利用上述具体实施例一设计的探针制备用于检测哈维弧菌群的基因芯片，具体步骤如 下： 1、 探针母液的配制 将探针冻干粉用RNAase-free水（即DEPC处理水）配制成100μπι/L的母液，振荡混匀 后，于4 °C、5000rpm/min离心lmin，得到探针母液，-20 °C保存； 2、 点样前准备 取0.2mL微量离心管，依次加入10μL的探针母液、10μL的点样缓冲液（SSC)，振荡 混匀后，于4 °C、5000rpm/min离心1min，取上清加样到384孔板中； 3、 点样 确认要点片的矩阵，并控制点样仪的湿度（75%)和温度（23°C)，采用高精度机械手点 样技术，将探针点到醛基修饰的玻璃片上，每条探针重复4次； 4、点样后处理 将点好的玻璃片放在装有饱和氯化钠溶液盒子中，于温度30 °C、湿度75%的条件下放 置72时；3天后，将点样好的玻璃片放入双蒸水中，于100 °C煮30s，即得到用于检测哈维 弧菌群的基因芯片，取出该基因芯片自然晾干后，放入芯片盒内，4 °C保存。基因芯片上各 组探针的位置如图1所示，采用高精度机械手点样技术，按照探针检测阵列的设计，将对应 探针固定到醛基基片上。
[0018] 具体实施例三 上述具体实施例二制备得到的用于检测哈维弧菌群的基因芯片的使用方法，具体步骤 如下： 1、样品选取： 采用模式菌株：溶藻弧菌（ATCC17749τ)、坎氏弧菌（MCCC1H0050T)、哈维弧菌（MCCC1H0031T)、需钠弧菌（MCCC1H0025T)、副溶血弧菌（MCCC1A02609T)和轮虫弧菌（CAIM 577τ);环境菌株：溶藻弧菌（NBV00022);七种细菌的标准