一种hla-b*1502检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及卡马西平个体化用药检测技术领域，尤其涉及一种HLA-B*1502检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 卡马西平是常见的抗精神性药物，临床上主要用于抗癫痫，也可用于三叉神经 痛等。在某些个体当中，卡马西平会导致史蒂文斯 -约翰逊综合征（StevensJohnson syndrome，SJS)和中毒性表皮坏死溶解症（toxicepidermalnecrolysis，TEN)，这是一种 严重的皮肤和粘膜反应，可导致永久性残疾甚至致命。在白种人中，由卡马西平引起的SJS/ TEN的几率很低，只有万分之一到万分之三，然而，在一些亚洲国家，包括南亚的印度人，患 者服用卡马西平而导致的SJS/TEN较白种人高出10倍左右。
[0003] 现已证实，SJS/TEN风险的增加与HLA-B*1502有关，并且这种关联性与个体中 HLA-B*1502纯合还是杂合无关，HLA-B*1502等位基因几乎仅存在于有亚裔血统的人群 中。美国食品药品监督管理局（FDA)建议，在开始使用卡马西平治疗之前，应对患者进行 HLA-B*1502等位基因检测，如经检测结果呈阳性，则不宜使用卡马西平，除非药品的预期收 益明显大于严重皮肤反应风险的增加。
[0004] 中国食品药品监督管理局（CFDA)在2015年发布的《药物代谢酶和药物作用靶点 基因检测技术指南（试行）》中明确指出，"携带HLA-B*1502等位基因者慎用卡马西平和苯 安英"。
[0005] 目前对HLA-B*1502的检测主要有直接测序法（PCR-SBT)、PCR-SSP法以及荧光定 量法。直接测序法优点是直观，可直接获取待检者的具体HLA类型，但是操作繁琐，所需试 剂和设备均被国外企业垄断，价格不菲，并且由于需要经常性的开管，很容易造成样本之间 的交叉污染，因此不适宜大规模推广；PCR-SSP法成本较低，操作简单，可准确得鉴定待测 样本是否含有HLA-B*1502等位基因，然而它最终也需要开管检测，进而增加样本间污染的 可能性，因此也不是检测大量样本的最理想方法；荧光定量法有很高的灵敏度，可快速准确 得进行分型，但需要比较昂贵的设备和探针。因此，探讨检测HLA-B*1502的新方向、新方 法、新技术很有必要。
[0006] 研究发现，在HLA-B基因座附近存在与某些亚型高度连锁的SNP，S卩"标签SNP"， HLA-B*1502的标签SNP是rsl0484555的C等位基因，二者的特异性可达99. 27%。因此， 通过检测标签SNP来检测样本的HLA-B的基因型是一种新的研究方向。
[0007]环介导等温扩增（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)技术是日本 科学家于2000年开发出来的一种恒温扩增技术，针对靶基因的六个区域设计四条特异性 引物，在链置换DNA聚合酶的作用下恒温扩增，可在十几分钟到一小时之内产生109-101(]数 量级的产物，反应结束后通过肉眼直接观察体系状态的改变来判定待测样本的基因型，无 需开管，因此大大简化了操作步骤，同时又可以有效避免样本交叉污染，而且，仅需普通水 浴锅即可开展检测，又节约了大量的检测成本。因此，采用LAMP方法检测HLA-B*1502的基 因型是一种新型且适于大规模使用的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的问题是现有的HLA_B*1502检测方法不理想，不适于大规模推广 使用。
[0009] 为解决上述问题，本发明在LAMP的基础上采用等位基因特异性环介导等温扩增 (Allele-SpecificLAMP)技术，针对HLA-B*1502的标签SNP进行检测，提供了一种适于推 广使用的试剂盒及检测方法。
[0010] 本发明的第一个目的在于提供一种HLA-B*1502检测引物，用于检测rsl0484555 的C等位基因，包括以下引物：
[0011]5'-AAATTGTTAAAGGTACTTGGAAAG-3，（SEQ IDNo.1，以下简称F3)
[0012]5'-CATCTAAAGTATACAATTCAATGGTT-3，（SEQ IDNo.2,以下简称B3)
[0013] 5 r -GCCATGAAGTAAATCCATAAATTTTGAGTTTGTGCCTGTCAAGCTAGGA-3 r (SEQ ID No.3,以下简称FIP)
[0014] 5，-AGAGAGACATATTATAAAGCCGTGGATCATATTCAGAGTTTTAAATCTGCA-3，（SEQ ID No. 4,以下简称BIP)。
[0015] 本发明提供的引物中，FIP是针对rsl0484555的C等位基因的特异引物，在其中 额外引进了一个突变，增加了引物的特异性，降低了非特异扩增的可能性，提高了检测的准 确性。
[0016] 优选地，所述F3、B3、FIP、BIP均为HPLC纯化法纯化后的引物。
[0017] 本发明的第二个目的在于提供一种HLA_B*1502检测试剂盒。所述试剂盒包括检 测rsl0484555位点基因型进而检测HLA-B*1502的组合物，所述组合物包括上述的引物，还 包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
[0018] 进一步地，所述组合物还包括用于显示组合物颜色的指示剂。
[0019] 优选地，所述指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物或者为羟基萘酚蓝。
[0020] 进一步地，所述检测组合物还包括甜菜碱或二甲基亚砜中的一种。其中，甜菜碱的 浓度大于0,小于等于1M。二甲基亚砜的浓度大于0,小于等于10% (体积分数）。
[0021] 优选地，所述组合物中甜菜碱的浓度为0. 8M。
[0022] 优选地，所述组合物中，F3和B3均为0. 4 μΜ，FIP和BIP均为1. 6 μΜ。
[0023]进一步地，所述缓冲液包括：Tris-HCl20mM，KCl50mM，（NH4)2S0410mM，MgS044mM， Tween_2〇0. 1 % (体积分数）。
[0024] 优选地，若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物，钙黄绿素为25μΜ，氯化锰为 0. 5mM。若指示剂为羟基萘酚蓝，其为120μΜ。
[0025] 优选地，所述组合物中dNTP为1. 4mM，Bst聚合酶为8U。
[0026] 本发明的第三个目的在于提供一种HLA-B*1502的检测方法。所述检测方法，使用 上述的HLA-B*1502检测试剂盒，具体为：将待检测的核酸加入到所述组合物中，得到的反 应体系于55~70°C下反应，反应结束后观察体系的变化。
[0027] 进一步地，所述待检测的核酸在反应体系中的浓度为0.8~4ng/μL。
[0028] 优选地，反应结束后，将反应体系进行灭活处理。灭活处理使得体系中的酶失活， 防止体系放置时间长时发生非特异性扩增，影响反应结果的判断。
[0029] 优选地，反应温度为58~65 °C。
[0030] 优选地，所述反应时间为40~120min。
[0031] 在本发明的反应体系中，反应前体系为澄清状态，发生阳性反应时，镁离子与副产 物焦磷酸形成沉淀，体系产生肉眼可见的沉淀，变为浑浊状态。观察体系状态的变化可以直 接判定是否发生扩增反应。
[0032]当体系中存在指示剂时：（1)若指示剂为羟基萘酚蓝，反应前体系中的镁离子与 dNTP螯合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，镁离子与副产物焦磷酸形成沉淀，溶液pH 发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色；（2)若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物 时，反应前钙黄绿素与氯化锰中的锰离子结合，体系呈现黄色；当有阳性反应时，副产物焦 磷酸与锰离子结合生成沉淀，钙黄绿素与体系中的镁离子结合，颜色逐渐由黄色变为荧光 绿色。观察反应体系颜色和/或状态的变化可以直接判定是否发生扩增反应。
[0033] 本发明具有的优点和积极效果是：（1)本发明采用Allele-SpecificLAMP技 术，针对rsl0484555的C等位基因设计了特异引物，利用rsl0484555的C等位基因与 HLA-B*15021的关联性判断患者是否携带HLA-B*1502等位基因，从而指导卡马西平个体化 用药，避免直接测试HLA-B*1502。（2)本发明运用Allele-SpecificLAMP技术，设计了特 异引物，测试后，观察反应体系的状态变化（是否有沉淀或者颜色的变化）即可判断是否发 生阳性反应，肉眼即可进行判断，无需额外的装置设备，简便易行，（3)使用本发明提供的检 测引物、试剂盒和方法进行检测，所需要的设备仅是水浴锅或金属浴或者热循环仪，检测成 本低；检测耗时较短；且本检测方法不需要额外的开管检测，因此有效避免了交叉污染的 产生，提高了检测的准确性。
[0034] 本发明提供的