一种用于肝癌检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于肝癌检测的试剂盒。维甲酸诱导蛋白RAI16在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质。现有技术的检测方法具有一定的局限性，不适宜廉价的大面积推广。本发明提供的试剂盒能够通过检测组织中蛋白的含量来鉴定时候患有肝癌，从而能够快速高效的检测肝癌。所述检测成本低廉，易于推广。
【专利说明】
一种用于肝癌检测的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于肝癌检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肝脏是人的主要消化器官，因不注意饮食卫生，它容易导致各种疾病，如各种肝 炎、肝腹水、肝硬化等，特别是肝癌，对人类的危害更大，很多时候人体并没有觉察，没有疼 痛感，当感觉到疼痛时已经进入了肝癌的晚期很难治疗，给病人带来很大的痛苦。
[0003] 原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是严重威胁人类生命健康的疾病。 肝细胞癌恶性程度高，容易复发和转移，预后差，而且早期诊断较困难，往往延误了最佳治 疗时期。我国是肝癌高发国家，每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%。发 病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为 增加，肝癌严重危害我国人民生命财产安全，并且是影响社会经济发展的一个重要因素。
[0004] 肝癌的及早发现和确诊对于提高患者的生存率至关重要，而目前广泛采用检测血 清中甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP)来确诊HCC,其敏感性、特异性及准确性均不理想， 尤其对肿瘤直径小于3cm的小肝癌患者，其敏感性及阳性率更低，仅分别为33%-65%和 9. 1%~26%(AFP>20ug/L)。近年来已有20余种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有 关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐 明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多 种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因、尤其是 肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。
[0005] 维甲酸诱导蛋白RAI16(Retinoic acid induced protein 16)的NCBI登录号为 NP_073586.5，Swissprot 登录号为 Q86V87，IPI 号为 IP100654780.2。维甲酸诱导蛋白 RAI16 是维甲酸诱导产生的蛋白分子，其结构与功能目前尚未清楚。维甲酸诱导蛋白RAI16最初是 在维甲酸诱导细胞分化时分离出来的，而维甲酸具有抑制细胞增殖、促进细胞调亡和促进 细胞分化的作用，已被应用于急性淋巴细胞白血病、肺癌及肝癌等多种癌症的治疗。
[0006] 现有技术已经发现维甲酸诱导蛋白RAI16在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织 中存在差异表达的蛋白质（在癌组织中上调表达）。因此，检测RAI16即可实现对肝脏疾病的 判断。但是现有技术中，蛋白的检测通常采用抗体的方法，由于抗体制备复杂，成本较高，因 此，在检测中并不适合廉价的推广。
[0007] 核酸适体(Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革E1标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)从人工合成的 DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体 的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功 能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优 良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透 组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物 检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种特异结合RAI16的核酸适体及其试剂盒。
[0009] 本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-23所示的单链DNA。
[00?0]所述核酸适体与RAI16蛋白具有较好的亲和能力。
[0011] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0012] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：
[0013] a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具 有相同功能的核酸适体的衍生物；
[0014] b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同 功能的核酸适体的衍生物；
[0015] c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物；
[0016] d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的 衍生物；
[0017] e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体 具有相同功能的核酸适体的衍生物。
[0018] 所述核酸适体可用于制备检测RAI16的试剂盒。
[0019] 利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的RAI16,从而用于脑血管病筛查。利用 本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获RAI16进行检测，具有高灵敏、成本低、易制 备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。
【具体实施方式】
[0020] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0021 ]实施例1、蛋白的制备以及核酸适体的筛选和制备 [0022] -.蛋白的制备
[0023]根据已有的维甲酸诱导蛋白RAI16的序列NP_073586.5,获得相应的基因序列，利 用CN 1318594 C中实施例1的真核表达蛋白的方法，进行蛋白的表达，采用常规的蛋白纯化 方法得到纯化的蛋白，浓度为l〇〇mg/ml，4度储存备用。
[0024] 二、适配体的制备
[0025]设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括35个核苷酸的随机核酸文库如下：
[0026] 5 ' -TGCAAGCAGTGACGAAGATC(N35)GGACAGTTGAAAGTTGACGA-3 ' ；N35代表35个随机核 苷酸。
[0027] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回 收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75yg RNA文库经 硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug RAI16蛋白，37°C孵育30min，反应 液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L尿素， 0.55mol/L醋酸铵，1.5mmol/L EDTA，0.15%SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20ylDEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用 于下一轮筛选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出 适配子库，筛选共进行13轮。得到了23个适配子，其序列分别为SEQ ID NO: 1-23所示。具体 序列如下所示：
[0051]实施例2 RAI16蛋白结合适配子的性能测定
[0052] 将适配子分别取1.5yg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷酸 化的适配子;通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32Ρ]ΑΤΡ于去磷酸化的适配子分子末端。lOnmol 放射性标记的适配子分别与不同浓度（1_200ηΜ)的RAI 16蛋白37°C孵育30min，各组反应液 经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样 品平行做两次测定。计算各个适配子与RAI16的解离常数。结果如下：
[0055]实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析
[0056]分别采用人血白蛋白，AFP蛋白，血清RBP4蛋白，磷脂酰肌醇蛋白，RAI16,与23条适 配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与 RAI 16蛋白结合保持较高的特异性。
[0057] 将所述的适配子，取0.5yg，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现四周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0058]实施例4所述适配子疾病的诊断
[0059] 获取40例肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，10例为正常人肝细胞组织对照。该 40例患者，均确诊，患有肝细胞癌，未经化学药物和放射性治疗。手术切除的新鲜组织块立 即置于冰上，用预冷的PBS冲洗3次，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，而后置于细胞裂解液 中，4°C裂解30分钟;在冰浴条件下，使用超声细胞破碎仪间歇超声破碎2分钟后，4°C13000g 离心15分钟，取上清采用改良Bredford法进行总蛋白定量。
[0060] 将23个适配子分别与标准品RAI16蛋白通过免疫磁珠分离的方式构建标准品检测 的标准曲线。然后将50组样本分别去10μ1加入到无菌离心管中，加入PBS溶液震荡溶解。分 别将偶联有磁珠的23组适配子与50组的样本溶液混合孵育20分钟（一种适配子对应检测50 组血清样本），而后磁分离，即可获得相应的分离的RAI16蛋白，通过标准曲线浓度检测获得 相应的蛋白浓度结果，通过检测，针对同一个样本，各适配子检测出的浓度几乎没有差距； 而各组之间的浓度存在明显的差异，以正常人的蛋白浓度的平均值作为对照，结果如下：
[0062] 从以上结果可以看出，肝癌患者的RAI16蛋白浓度显著的增加，与正常人之间可以 显著的区分开来。说明本发明的适配子可以用于检测分析。
[0063]以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于：含有能特异性检测RAI16蛋白的核酸适 体。2. 如权利要求1的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体序列如SEQ ID No. 1-23任一条序 列所示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。3. 权利要求1-2任一项所述的试剂盒在检测肝癌中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK106093434SQ201610451538
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】曹帅
【申请人】曹帅