人降钙素原胶体金定量检测卡的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗人降钙素原抗体及其应用。本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人临床样本检测的人降钙素原的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡。
【专利说明】
人降钥素原胶体金定量检测卡
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种抗人降钙素原(PCT)抗体及其制备方 法以及上述抗体在人降钙素原检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 降f丐素原(Procalcitonin，PCT)是一种无激素活性的糖蛋白，由降f丐蛋白、降|丐 素、N端残基片段组成，是降钙素(Calcitonin，CT)的前体，相对分子量13KDa，半衰期25-30 小时。生理条件下，PCT主要由甲状腺滤泡旁C细胞产生；病理状态下，PCT可来源于肝、肺等 多种器官和组织。
[0003] PCT在临床上具有广泛而又重要的应用价值。健康人血浆PCT含量极低，在正常人 血中低于0.5ng/ml。当发生严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时， 它在血浆中的水平升高;而发生自身免疫、过敏和局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、 癌症发热、移植物宿主排斥反应等疾病时，PCT水平不会升高；这就决定了PCT的高度特异 性，因此可用于各种临床情况的鉴别诊断。此外，PCT浓度和炎症严重程度成正相关，并随着 炎症的控制和病情的缓解而降低至正常水平，因而PCT又可作为判断病情与预后的可靠指 标。PCT可在感染后2个小时后检测到，对临床早期诊断具有重要意义，在感染后12~24小时 达到尚峰。
[0004] 目前检测PCT常用的实验室方法有放射免疫学分析法(RIA)、化学发光免疫分析法 (CLIA)、胶体金比色法(GICA)和酶联免疫法(ELISA)。放射免疫学分析法是利用人工合成的 多克隆抗体特异地识别和连接降钙素原。该方法能检测正常人的血清PCT，但检测的是游离 PCT、结合型PCT和降钙素基因相关肽前体的混合物，而不能区分上述三种物质;且存在检测 耗时长（19~22h)，有放射性元素的污染，标记物稳定性差，废弃物难以处理等缺点而使其 应用受到限制。化学发光免疫分析法(CLIA) -般需要配套昂贵的全自动电化学发光检测 仪，常规实验室无法开展，而且给患者带来不必要的费用，增加患者负担。而利用生物素-亲 和素系统检测PCT的电化学发光免疫试剂盒，也需要配套昂贵的全自动电化学发光检测仪， 常规实验室无法开展，而且给患者带来不必要的费用，增加患者负担。而本发明胶体金检测 试纸条可满足快速检测及床边检测的需求且无需专业技术人员。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人降钙素原的抗体。更具 体地说：
[0006] 本发明的第一目的在于提供一种抗人降钙素原抗体，
[0007] 其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 1所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0:2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0:3所示的HCDR3;
[0008] 以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID N0:4 所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。
[0009] 优选的是本发明中的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链 可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0010] 本发明第二个目的是提供一种单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0011] 本发明第三个目的是提供一种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体的 核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示。
[0012] 本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。
[0013] 本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞 可以是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为毕赤酵母。
[0014] 本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：
[0015] 1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；
[0016] 2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
[0017] 本发明的第七个目的在于提供上述抗人降钙素原抗体在检测人降钙素原含量中 的应用。
[0018] 本发明的第八个目的在于提供一种可配对检测人降钙素原的抗体对:外购抗降钙 素原抗体MJG03(购于杭州启泰生物技术有限公司，编号为MJG03)和本发明的抗人降钙素原 抗体;该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。
[0019] 本发明的第九个目的在于提供一种利用所述抗人降钙素原抗体检测人降钙素原 的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫;所述金标垫喷涂有 胶体金颗粒标记的本发明的抗人降钙素原抗体或MJG03,所述反应膜上有检测带和质控带， 检测带位置包被有抗体MJG03或本发明的抗人降钙素原抗体，质控带位置包被抗His标签抗 体或Protein L〇
[0020] 本发明制备了多种抗体，并与商业化抗体进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均 能满足需求的抗体组合(本发明的抗人降钙素原抗体及MJG03);同时其方便大量生产，可满 足曰后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作 简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均可满足人临床样本检测的人降钙素原的胶体金免 疫层析定量检测卡。
【附图说明】
[0021] 图1.抗体重链及轻链可变区基因电泳图。Lane 1为200bp DNA Ladder;Lane 2为 本发明的人降钙素原抗体重链可变区DNA;Lane 3为本发明的人降钙素原抗体轻链可变区 DNA〇
[0022] 图2.单链抗体结构示意图。VH表示重链可变区序列，VL表示轻链可变区序列，His标 签为六个组氨酸。
[0023] 图3.单链抗体基因 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0024]图4.重组单链抗体毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液SDS-PAGE电泳鉴定图。
[0025]图5. SDS-PAGE鉴定单链抗体纯化效果图。
[0026]图6.本发明胶体金免疫层析定量检测卡结构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为 吸收垫、4为质控线(C线）、5为检测线(T线）、6为金标垫、7为PVC片材。
[0027]图7.本发明胶体金免疫层析定量检测卡检测范围拟合曲线。其中横坐标为蛋白浓 度(ng/mL);纵坐标为检测值;r2为0.999。
[0028]图8.本发明胶体金免疫层析定量检测卡线性范围拟合曲线。其中横坐标为理论浓 度(ng/mL);纵坐标为检测值;r2为0.998。
[0029] 图9.本发明胶体金免疫层析定量检测与市售同类产品比对结果相关性。
【具体实施方式】
[0030] 定义
[0031] "抗体"又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形 的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所 述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。
[0032] "单链抗体"（scFv)指的是抗体的重链可变区（Vh)和轻链可变区（Vl)通过15~20个 氨基酸短肽(1 inker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的1 inker通常富含甘氨酸和丝 氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将Vl的N端连接至VH的C末端，或者相 反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有 分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
[0033] 互补决定区（complementarity-determining region，CDR)，也叫做高变区。成型 于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗 体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。
[0034] 实施例1.抗人降钙素原杂交瘤细胞株的制备
[0035] 1.动物免疫
[0036]以人重组降钙素原按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠（购自常州卡文斯实验 动物有限公司）。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免 疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行 融合实验。
[0037] 2.细胞融合
[0038] (1).脾脏细胞的制备
[0039] 将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75% (v/v)的酒精中浸泡10分钟， 于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基 (购自Gibco公司）离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。
[0040] (2).饲养细胞的制备
[0041] 取8~10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置 75 % (v/v)酒精中浸泡10分钟;无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培 养基(购自SIGMA公司）注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养 基注入20 % 1640HAT培养基中备用；
[0042] 取2~3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75% (v/v)酒精中浸泡 10分钟;无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的 20 % 1640HAT培养基中，备用。
[0043] ⑶·细胞融合
[0044]选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0,收集并计数。取约108个上述脾 细胞与2Χ107个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，lOOOrpm离心10分钟后弃上清(尽量 弃净），将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入lmL预热的 PEG1450(聚乙二醇1450,购自SIGMA公司），加入1640HT培养基30mL终止，lOOOrpm离心10分 钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20 %的1640HAT培养基中。
[0045] 将上述HAT培养基充分混匀后，以200yL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37°C，5% C〇2的细胞培养箱中培养。一周后用10%1640HT培养基替换20%1640HAT培养基，3天后取上 清进行检测。
[0046] 3.抗人降钙素原特异性杂交瘤株筛选
[0047] (1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组PCT至lyg/mL，包被96孔ELISA酶标板， lOOyL/孔，2~8°C包被过夜，洗涤一次拍干;含2%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin， BSA，购买于盐城赛宝生物科技有限公司）的TOST缓冲液封闭（200ul/孔），37°C封闭2小时； 拍干，备用。
[0048] (2).阳性克隆的筛选:将待检细胞培养上清100此/孔加入上述检测板中，于37°C 作用30分钟后洗涤并拍干，加入lOOyL/孔的HRP标记的羊抗鼠 IgG，于37°C作用30分钟后洗 涤并拍干，加入l〇〇yL/孔的TMB显色液，于37°C避光显色15分钟，每孔加入50yL的2M H2S〇4终 止反应，并于0D450处读取数值。阳性孔确定原则:0D450值/阴性对照值彡2.1。选取阳性克 隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100%即确 定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。选择具有较高效价的杂交瘤细胞株，遂后续进一步对 上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。
[0049] 实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定
[0050] 对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。
[0051 ] a. RNA的提取:参照细胞总RNA抽提试剂盒(购自Roche公司）说明书对上述杂交瘤 细胞株进行总RNA提取并立即进行反转录；
[0052] b.RNA反转录成为DNA:参照Thermo Scientific Reverted First strand cDNA Synthesis Kit(购自Thermo公司）对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻 存于-20 °C备用；
[0053] c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，以鼠 IgG亚型单 克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR产 物经DNA胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司）进行回收，见附图1;
[0054] d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pMD 18-T kit(购自Takara公司） 说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pMDl 8-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取 阳性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
[0055] 测序得到杂交瘤细胞株C01的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示、轻 链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各 互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID N0:1所示的HCDR1、如序列SEQ ID N0:2所 示的Η⑶R2和/或如序列SEQ ID N0:3所示的Η⑶R3;其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸 序列是：如序列SEQ ID Ν0:4所示的LCDR1、如序列SEQ ID Ν0:5所示的LCDR2和/或如序列 SEQ ID 从):6所示的1^0)1?3。
[0056] 实施例3.单链抗体的重组表达及纯化
[0057] 根据实施例2中测序结果，将杂交瘤细胞株抗体重链及轻链可变区之间加入连接 肽(GGGGS)3,引入六个组氨酸标签见SEQ ID N0:9,并将其融合组氨酸标签全基因按照毕赤 酵母表达系统的偏爱性进行密码子优化的方法，进行单链抗体的重组表达。其结构组成如 附图2所示。上述单链抗体的重组表达具体如下：
[0058] 1.单链抗体基因的表达质粒构建
[0059]密码子优化后的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示、氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。将优化后的单链抗体全基因合成的片段上游引入pPICZaA载体中Xho頂每切 位点，下游引入Xbal酶切位点，构建到pUC57质粒(购自Invitrogen公司）中，得到一种长期 保存质粒，质粒记为PUC57-T03。进行PCR扩增，其中上游引物P1为：5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；下游引物P2为:5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'。常规PCR程序后，琼脂糖凝胶 电泳分析（附图3)，显示产物大小与预期大小（750bp)-致。将PCR获得基因产物回收纯化 后，采用XhoI(#R0146S,购自 New England Biolabs 公司）和 XbaI(#R0145V,购自 New England Biolabs公司）双酶切，用T4连接酶连接到pPICZaA(V19520,购自Invitrogen)质粒 中，转化到DH5a感受态细胞中，在含有Zeocin(R250-01，购自Invitrogen公司）的LB平板中 37°C培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到抗体的表 达质粒，分别记为pPICZa-T03。
[0060] 2.单链抗体基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达
[0061 ] YPDS固体培养基配制：参照Invitrogen公司EasySelect Pichia Expression Kit 说明书;毕赤酵母感受态细胞:参照EasySelect Pichia Expression Kit说明书;BMGY培养 基配制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书；BMMY培养基配 制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书。
[0062]将pPICZa-T03质粒，用SacI限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉淀后将线性化载体， 分别电转化进入到X-33感受态酵母细胞，分别涂布到含有Zeocin的YPDS固体培养基，30°C 培养3-5天，就有阳性克隆产生。
[0063] 挑取上述获得的单克隆于5mL BMGY培养基中，30°C培养至0D6Q() = 2.0~6.0时，取 lmL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移至IjBMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓 度为1 % (v/v)。一周后，离心收集菌液上清，通过SDS-PAGE凝胶电泳分析，鉴定目标蛋白表 达情况(附图4)。
[0064] 将上述获得的单链抗体重组基因工程菌株接种于BMGY培养基中，30°C，220rpm培 养至菌体密度到0D6Q() = 2.0~6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0% (v/v)。一周后，收 集发酵培养液。
[0065 ] 3.单链抗体纯化
[0066] 采用组氨酸标签亲和柱纯化抗体融合蛋白，预装柱子选择为HisTrap HP，具体步 骤如下：
[0067]步骤一、发酵液的除杂预处理:将上述表达得到抗体融合蛋白发酵液上清，离心收 集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mM NaCl，20mM NaH2P04，10mM Imidazole，调pH7 · 5，0· 45μηι 滤膜过滤。
[0068] 步骤二、HisTrap HP亲和柱纯化:运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTA avantl50， 购自GE healcare公司）对预处理获得的抗体融合蛋白发酵液进行亲和纯化，柱子为 HisTrap HP(17-5248-02,购自 GE healcare 公司）。结合缓冲液为 300mM NaCl，20mM NaH2P〇4，10mM Imidazole，pH7.5,洗脱缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH2P〇4,500mM Imidazole，pH7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。通过SDS-PAGE电泳鉴定纯度， 由附图5可知，两种纯化后的蛋白纯度均达到95%以上;合并符合要求的收集管，更换缓冲 液为PBS溶液并超滤浓缩(lmg/ml)，过滤除菌于-20°C保存备用。
[0069]本领域技术人员知晓，重组蛋白可以不带标签，也可带其他标签，也可加入其他形 式的连接肽。无论是否带标签或者带不同形式的标签都可采用Capto L纯化。
[0070]实施例4.单链抗体的性能评价 [0071 ] 1、抗体的Western blot鉴定
[0072] a.聚丙烯酰胺凝胶电泳:配置12%SDS_聚丙烯酰胺凝胶;分别上样标准蛋白质及 重组PCT蛋白，恒压下电泳1小时；
[0073] b.转膜:恒流(35mA/膜)条件下转膜1小时，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质分别转 移至硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的聚丙烯酰胺凝胶进行染色，观察蛋白 的残留情况；
[0074] c.封闭：含5 %脱脂奶的TBST缓冲液封闭（封闭液），4°C过夜;封闭后洗涤液(TBST， 详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涤一次，10分钟；
[0075] d.抗原抗体反应：封闭液稀释（按1: 400体积比）辣根过氧化物酶标记单链抗体 (lmg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同），加入上述硝酸纤维素膜中，室温反应1小 时;TBST洗涤5次，每次10分钟；
[0076] e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，每张硝酸纤维素膜分别加入2mL稳 定型过氧化物酶溶液（lmL)与鲁米诺/增强剂溶液（lmL)的混合液(购买于Thermo公司），均 匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像系统（购买于GE公司）拍 照，留取结果。
[0077] 实验结果表明，本发明抗体可降钙素原蛋白反应，证明了本发明抗体与降钙素原 蛋白的结合力
[0078] 2、单链抗体在胶体金检测平台的评价
[0079] 将实施例3中纯化的抗体与MJG03抗体(购买于杭州启泰生物技术有限公司）进行 配对组合，分别作为包被抗体或标记抗体进行配对检测降钙素原(PCT)，检测步骤如下：
[0080] 1)用抗体包被液将单链抗体稀释至lmg/ml，划线于硝酸纤维素膜上；
[0081 ] 2)用0.01M PB缓冲液将胶体金标记的抗体MJG03稀释3倍后铺于金标垫上；
[0082] 3)按附图6所示贴膜，切条，装卡(具体制备参见实施例5)
[0083] 4)用样本稀释液稀释PCT重组抗原，至浓度为50ng/ml，lng/ml，将这两个浓度标准 品和零浓度标准品（即样本稀释液)分别添加50ul到胶体金检测卡中，lOmin后将检测卡放 置在读数仪上进行读数。结果如下表所示：
[0085] 由上述结果可知，可见本发明单链抗体作为包被抗体，MJG03作为标记抗体组成的 双抗体夹心法检测系统可应用于胶体金检测平台；此外，发明人也同时验证了抗体MJG03作 为包被抗体，单链抗体作为标记抗体组成的双抗体夹心法检测系统同样可应用于胶体金检 测平台。
[0086] 实施例5抗人降钙素原胶体金免疫检测卡的制备
[0087] 1、溶液配制
[0088] 1)0·01Μ PB缓冲液制备：称取Na2HP〇4 · 12H20 3.22g，NaH2P〇4 · 2H20 0.15g，加纯 化水1000ml，转子搅拌至溶解，用ph计测定其pH7.4 ± 0.1，0.45um滤膜过滤。
[0089] 2)封闭液制备：称取牛血清白蛋白5g，加0.01M 1?溶液(PH7.4 ± 0.1) 50ml，转子搅 拌至溶解。
[0090] 3)抗体包被液制备：0.01M PB溶液(PH7.4 ± 0.1)。
[0091] 4)金标抗体复溶液制备:称取lg牛血清白蛋白，5g海藻糖，加入100ml 0.01M 1?溶 液(pH7.4±0.1)，转子搅拌至溶解后，加入25ul Tween-20，继续用转子搅拌5-10min。
[0092] 5)样本稀释液制备：称取12.5g牛血清白蛋白加入500ml 0.01M PB溶液(PH7.4土 〇. 1)，转子搅拌至溶解，加入〇.5ml Proclin300,继续用转子搅拌5-10min。
[0093] 2、人降钙素原胶体金检测卡制备
[0094] 1)胶体金的标记
[0095]抗体MJG03的胶体金标记（以lml胶体金溶液标记为例）：用ΚΚ03调节胶体金pH值 (每lml胶体金中加入5ul 0.2M K2C03)，搅拌5-10分钟，向胶体金溶液中缓慢加入抗体MJG03 (每lml胶体金中加入25ug抗体MJG03)，低速搅拌30分钟；加入封闭液BSA至其终浓度为10% (质量百分比），搅拌20分钟；静置30min后12000rpm离心30min;去上清用100ul金标抗体复 溶液复溶沉淀即得胶体金标记的MJG03抗体。
[0096] 2)金标垫及反应膜制备
[0097]将MJG03金标抗体稀释3倍后，喷涂在金标垫6上，干燥备用；
[0098]将单链抗体用抗体稀释液稀释至1.0mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的T 线5位置;将抗His标签抗体用抗体稀释液稀释至0.2mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素 膜)的C线4位置，反应膜干燥备用。
[0099] 3)贴膜、切膜、组装
[0100] 将样品垫1、金标垫6、包被有抗体的硝酸纤维素膜2、吸水垫3从左至右依次设置 (如图6所示），且两两之间应少许接触，所述包被有抗体的硝酸纤维素膜的T线5在左、C线4 在右，并根据外壳大小进行切割，装入外壳，完成检测卡制备。
[0101] 4)试剂盒组装
[0102] 将组装好的检测卡，干燥剂装入铝箱袋中，热封机封口；
[0103] 将样本稀释液按lml/管进行分装，并按照试剂盒规格装入自封袋。
[0104] 3、人降钙素原胶体金检测卡使用方法
[0105]吸取50ul样本加入检测卡的加样孔中，室温下静置lOmin，读取检测结果。
[0106] 4、人降钙素原胶体金检测卡检测效果评估
[0107] 1)精密性:将单链抗体(包被)-MJG03(标记)检测卡按检测卡使用方法检测0.1、 10、50ng/ml的PCT参考品各10次重复测定，剔除离群值后计算检测卡精密度。实验结果显示 三个浓度检测结果变异系数CV〈15%。
[0109] 2)检测范围：将单链抗体(包被)-MJG03 (标记)检测卡检测不同浓度的PCT重组蛋 白0.1、0.4、0.8、1.6、3.2、6.2、12.5、25、50邱/1111，拟合曲线及检测范围为0.1-501^/1111(如 附图7)。
[0110] 3)线性范围：将高值样本与样本稀释液按照一定比例配制成5个系列浓度样本，浓 度分别为〇 · lng/ml，12 · 5ng/ml，25ng/ml，37 · 5ng/ml，50ng/ml，用单链抗体（包被）_MJG03 (标记)检测卡检测，每个样本检测3次，将结果与理论浓度进行回归统计，判断在该浓度范 围内是否成线性。线性范围为〇. l-50ng/ml(如附图8)。灵敏度为0. lng/ml。
[0111] 4)准确度:将单链抗体(包被)-MJG03 (标记)检测卡按检测卡使用方法检测浓度为 0.1、10、50即/1111的？(：1'重组蛋白各3次重复，计算平均值和理论值的相对偏差，实验结果显 示三个浓度检测结果相对偏差B〈15%。
[0113] 5、准确度一方法学比对：
[0114] 选择同类产品中目前市场上获得良好信誉的广州万孚生物技术股份有限公司降 钙素原定量检测试剂盒(胶体金法)作对照产品比对验证。选择20份临床病人标本，按1到20 的顺序编号，用对照产品和待评价的单链抗体(包被)_MJG03(标记)的胶体金检测卡同时进 行实验，按照1，2，3......18，19，20，20，19，18......3，2，1的样本顺序进行测定。对照和待 评价产品的检测结果相关系数R2 = 〇.988,说明两种方法检测结果有较好的相关性(如附图 9)〇
[0115] 6、配方筛选
[0116] 除上述最优制备例1外，
【申请人】还尝试多种制备方案，应用结果如下表：
[0117]
【主权项】
1. 人降钙素原胶体金定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫;所述金 标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗人降钙素原抗体或MJG03,所述反应膜上有检测带和质控 带，检测带位置包被有抗体MJG03或人降钙素原抗体，质控带位置包被抗His标签抗体或 Protein L； 所述抗人降钙素原抗体，包括： 重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的HCDR1、如SEQ IDN0:2所示的HCDR2和/或如SEQIDN0:3所示的HCDR3; 以及轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的 LCDR1、如SEQIDN0:5所示的LCDR2和/或如SEQIDN0:6所示的LCDR3。2. 权利要求1所述的人降钙素原胶体金定量检测卡，其特征是所述的抗人降钙素原抗 体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。3. 权利要求1所述的人降钙素原胶体金定量检测卡，其特征是所述的抗人降钙素原抗 体氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。4. 权利要求1-3任一项所述的人降钙素原胶体金定量检测卡，其特征是封闭液是含 10 % BSA的0 · 01M pH7 · 4 ± 0 · 1 的PB缓冲液。5. 权利要求1-3任一项所述的人降钙素原胶体金定量检测卡，其特征是抗体包被液是 0.01M PB溶液，ΡΗ7·4±0·1。6. 权利要求1-3任一项所述的人降钙素原胶体金定量检测卡，其特征是样本稀释液是 含2 · 5 % BSA的0 · 01Μ ρΗ7 · 4 ± 0 · 1 的ΡΒ缓冲液，其中每lOOmlPB缓冲液加0 · lml Procl in300。
【文档编号】G01N33/68GK106093431SQ201610397923
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】马永, 丁娜, 时振华
【申请人】江苏晶红生物医药科技股份有限公司