一种快速定量检测l-fabp的胶体金试纸的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种快速定量检测L-FABP的胶体金试纸，所述胶体金试纸包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4，另一端连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件7，上方设有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位检测线8包被有L-FABP抗体，检测线两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于临床医学诊断领域，具体涉及一种用于定量检测L-FABP的胶体 金试纸。 一种快速定量检测L-FABP的胶体金试纸
【背景技术】
[0002] L-FABP(肝型脂肪酸结合蛋白）属于脂肪酸结合蛋白（FABP)家族的成员之一，是 一组低分子量的可以结合长链脂肪酸的高保守性胞质蛋白。根据其组织特异性分布，已经 分离出9种不同的FABP，分别为肝型（L-FABP)、小肠型（I-FABP)、心肌型（H-FABP)、脂肪细 胞型（A-FABP)、表皮型（E-FABP)、回肠型（II-FABP)、脑型（B-FABP)、髓鞘型（M-FABP)、睾 丸型（T-FABP)，主要在肝脏、小肠及肾脏表达。在肾脏中，L-FABP主要表达在近曲小管，在 肾脏疾病出现大量蛋白尿、缺血和毒性等损害时，推测L-FABP参与尿夜游离脂肪酸的重吸 收，促进β氧化供能，从而减轻氧应激损伤，从而保护肾脏。Yamamoto等人在研究肾脏缺血 /再灌注与急性缺血性肾损伤的联系，用缺氧指示剂派莫硝唑显示组织缺氧损伤的范围，结 果发现，在缺血/再灌注后2h时，在人L-FABP转基因小鼠和野生小鼠的肾组织中在肾脏外 髓质和皮质部均出现派莫硝唑阳性区域，但转基因小鼠的损伤范围明显较小。进一步在缺 氧状态下，通过检测转基因小鼠近端小管细胞和非转染细胞中R0S水平，发现转基因小鼠 近端小管细胞R0S水平较非转染细胞显著下降，此研究结果提示高表达肾脏可能起到预防 近端小管细胞发生缺血/再灌注损伤的作用。L-FABP分子质量较小，只有14. 4KD，在肝细 胞、肾小管细胞受到损伤时，细胞膜通透性变化可使其快速溢出，因此L-FABP可作为一个 敏感、特异的组织损伤标志物，能很好的反应肾小管的损伤。
[0003] 在肾脏中，L-FABP最引人注目的临床应用是作为AKI (急性肾损伤)诊断生物标志 物。在一项研究尿L-FABP与AKI的关系中，对92例AKI患者与62例无 AKI患者进行横断 面研究，采用R0C曲线评价L-FABP诊断AKI的能力，R0C曲线下面积为0. 93,是一个很好的 AKI诊断分子标志物，并且研究指出，尿L-FABP含量越高，病人预后越差。
[0004] 另外，近期的研究表明，尿L-FABP可以很好地预测AKI的发生。Portila等人的 研究发现，在CBP手术后4h，尿L-FABP的含量在AKI患者中的含量显著高于非AKI患者的 L-FABP含量。根据R0C曲线分析，AUC为0. 810,可以作为手术后独立预测AKI风险的生物 标志物；在一项临床研究中，在感染性休克ICU病人中，约30%左右的ICU病人，被检测出患 有AKI，并且结果显示L-FABP作为标志物在判断感染性休克病人并发AKI时，R0C曲线上 的AUC高达0. 99,除此之外，研究结果还显示，病死患者中尿L-FABP的含量显著高于存活者 的尿L-FABP的含量，尿L-FABP的含量与死亡率成显著性正相关，可以说明L-FABP在预测 I⑶患者的死亡率方面有着非常好的效果；而在一项造影剂与AKI关系的研究中证实，66患 者中有13人在非急诊血管造影前就出现尿L-FABP显著升高；随后，13人都出现了造影剂 引发的肾病，尿L-FABP可以作为预测和诊断患者使用造影剂而导致的造影剂急性肾损伤 (CI-AKI)。
[0005] 随着其它的研究逐步深入，尿L-FABP显示在检测局灶性肾小球坏死、糖尿病肾 病、冠脉造影剂所致肾病、心脏转流术后急性肾损伤以及肾脏移植缺血再灌注造成的肾损 伤方面，均显示了非常好的预测作用。所以，尿L-FABP可以作为非常好的诊断AKI以及预 测AKI的生物标志物。
[0006] 免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志 物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuC14)在还原剂如 白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成 为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正 电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体 金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合。根据胶体金的一些物理性 状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶 体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0007] 目前，检测L-FABP(肝型脂肪酸结合蛋白）的方法目前主要是酶联免疫技术 (ELISA)，ELISA技术存在以下缺点：检测设备要求高，成本高；干扰因素较多，重复性不好； 检测时间长。因此酶联免疫技术检测L-FABP不适合临床快速诊断。鉴于目前尚无快速的 定量检测方法，本实用新型的目的是提供一种可用于快速定量检测L-FABP的胶体金试纸 以及一种可用于快速定量检测L-FABP的胶体金试纸盒，所述胶体金试纸和胶体金试纸盒 具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点。 实用新型内容
[0008] 本实用新型的一个目的是提供一种快速定量检测L-FABP的胶体金试纸，本实用 新型所述快速定量检测L-FABP的胶体金试纸具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点， 适于临床快速检测。
[0009] 本实用新型的技术方案是：
[0010] 一种快速定量检测L-FABP的胶体金试纸，包括支撑垫片5,位于所述支撑垫片上 的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4,另一端连接偶合物垫片2,所述 偶合物垫片连接样本垫片3,所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件7,上方设有 第二固定部件6,其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位检测线8包被有L-FABP抗体， 检测线两边分别设有控制线9,所述偶合物垫片2上涂布有金标记的L-FABP单克隆抗体或 多克隆抗体以及控制线偶合物。
[0011] 优选地，所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶 体金。BSA是牛血清白蛋白。
[0012] 优选地，所述第一固定部件7为双面胶，第二固定部件6为单面胶。
[0013] 优选地，所述两条控制线9与检测线8为平行设置。
[0014] 本实用新型的另一个目的是提供了一种快速定量检测L-FABP的胶体金试纸盒， 在本实用新型所述的定量检测L-FABP的胶体金试纸的基础上还包括一外壳10。
[0015] 所述外壳优选塑料外壳。
[0016] 所述外壳包裹所述试纸，露出样本垫片3、硝酸纤维素膜1上的检测线8和两条控 制线9、以及吸水垫4。
[0017] 本实用新型所述的试纸盒具有方便携带和贮存的优点。
[0018] 本实用新型所述的快速定量检测L-FABP的胶体金试纸或试纸盒的工作原理是： 采用双向侧流免疫反应原理，通过双抗体夹心法制备而成。检验时样本中的L-FABP抗原首 先与偶合垫上的L-FABP抗体偶合物发生免疫反应，形成免疫复合物。其后免疫复合物随着 样本在硝基纤维素膜上层析流动，当免疫复合物层析至硝基纤维素膜上的检测区（L-FABP 检测线）时，与预先包被在硝基纤维素膜上的抗L-FABP抗体发生反应从而被固定在硝基纤 维素膜的检测线上。样本中的L-FABP越多，检测线上的复合物越多，条带上的光密度值就 越高。同时，在检测过程中，控制线偶合物（即DNP-BSA标记的胶体金)，也会随样本在硝基 纤维素膜上层析，当层析至硝基纤维素膜的控制线时，DNP-BSA胶体金会与预先包被在硝基 纤维素膜上的抗DNP抗体发生反应从而被固定在对照区(控制线）上。由于胶体金为红色， 因而固定在硝基纤维素膜控制线上的抗DNP中的DNP-BSA胶体金免疫复合物将显示红色。 当样本中不含L-FABP时，则只显示两条控制线。当样本含L-FABP时，检测线就会清晰的显 示出来。
[0019] 当反应结束后，利用多功能免疫检测仪（瑞莱生物工程(深圳）有限公司）将控制 线和检测线的光密度进行分析，并将所分析得到的结果进行运算，从而得到相对光密度值 (RI)。然后检测仪根据已预先设置在检测仪内的标准曲线对L-FABP的浓度进行计算并显 示结果，以ng/mL为单位表示。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是本实用新型所述快速定量检测L-FABP的胶体金试纸的一种优选实施方式 的结构示意图。
[0021] 其中，1:硝酸纤维素膜，2 :偶合物垫片，3:样本垫片，4:吸水垫，5:支撑垫片，6: 单面胶，7:双面胶，8:检测线，9:控制线。
[0022] 图2是本实用新型所述快速定量检测L-FABP的胶体金试纸盒的一种优选实施方 式的示图。
[0023] 其中，3:样本垫片，8:检测线，9:控制线，4:吸水垫，10 :外壳。
【具体实施方式】
[0024] 以下结合附图对本实用新型所述快速定量检测L-FABP的胶体金试纸或试纸盒进 行详细说明，不能理解为是对本实用新型的限制。以下实施例中所使用的材料和试剂除特 别说明外，均为普通市售。
[0025] 【实施例1】制备快速定量检测L-FABP的胶体金试纸
[0026] 如图1所示的胶体金试纸结构，包括支撑垫片5,位于所述支撑垫片上的硝酸纤维 素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端上方层叠连接吸水垫4,另一端上方层叠连接偶合物垫片 2,所述偶合物垫片远离硝酸纤维素膜1的一端上方层叠连接样本垫片3,所述样本垫片另 一端部的下方粘接双面胶7,上方粘接单面胶6,其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位 检测线8包被有L-FABP抗体，检测线两边分别设有控制线9,所述偶合物垫片2上涂布有金 标记的L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。
[0027] 所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。
[0028] 其中，硝酸纤维素膜1在胶体金试纸中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的 发生处；检测线8是将L-FABP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释到0. 5mg/ml的浓度，取 lul/cm划线于所述硝酸纤维素膜1上，37°C过夜干燥及60°C烘烤3天，即得；控制线9是将 抗DNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释到0. 5mg/ml的浓度，取lul/cm划线于所述硝酸 纤维素膜1上，37°C过夜干燥及60°C烘烤3天，即得。
[0029] 其中，所述偶合物垫片2的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片 的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液(包含〇. 1-1%的酪蛋白，〇. 5-5%的牛血清白蛋白、 0. 005-0. 5%的硼酸、0. 01-0. 2%的PEG)中浸泡5分钟后取出，37°C干燥后，用Biodot包膜 仪器将金标记的L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物涂布在偶合物垫片2 上，涂布量是lul/mm，干燥，即得。优选地，所述偶合物垫片2的预封闭缓冲液包含0. 8%的 酪蛋白，4%的牛血清白蛋白，0. 007%的硼酸，0. 1%的PEG。
[0030] 其中，所述样本垫片3可对液态样品起到初步过滤作用。将样本垫片用141封闭 液(包含：〇. 1-1%的Tris，0. 1-1%的酪蛋白，0. 05-0. 5%的鼠抗人红细胞）浸泡5分钟后，过 夜37°C干燥，即得。优选地，所述141封闭液包含：0. 3%的Tris，0. 8%的酪蛋白，0. 3%的鼠 抗人红细胞。
[0031] 将上述各组成部件按图1所示结构粘贴在支撑垫片5上，获得快速定量检测 L-FABP的胶体金试纸。
[0032] 【实施例2】用本实用新型所述胶体金试纸快速定量检测L-FABP
[0033] 取本实用新型优选的一种快速定量检测L-FABP的胶体金试纸，如图1所示，所述 胶体金试纸包括支撑垫片5,位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的 一端上方层叠连接吸水垫4,另一端上方层叠连接偶合物垫片2,所述偶合物垫片远离硝酸 纤维素膜1的一端上方层叠连接样本垫片3,所述样本垫片另一端部的下方粘接双面胶7， 上方粘接单面胶6,其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位检测线8包被有L-FABP抗 体，检测线两边分别设有控制线9,所述偶合物垫片2上涂布有金标记的L-FABP单克隆抗体 或多克隆抗体以及控制线偶合物。优选地，所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶 合物为DNP-BSA标记的胶体金。按以下步骤进行检测：1)收集的病人尿液样品，如低温保 存样品需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片3上，反应。3)判读，将所述胶体金试 纸置于多功能免疫检测仪，SSJ-2或MINI (瑞莱生物工程(深圳）有限公司）中判定结果。
[0034] 【实施例3】用本实用新型所述胶体金试纸盒快速定量检测L-FABP
[0035] 取本实用新型优选的一种快速定量检测L-FABP的胶体金试纸盒，如图1和图2所 示，所述胶体金试纸包括支撑垫片5,位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤 维素膜的一端连接吸水垫4,另一端连接偶合物垫片2,所述偶合物垫片连接样本垫片3,所 述样本垫片另一端部的下方粘接双面胶7,上方粘接单面胶6,其特征在于，所述硝酸纤维 素膜1中间部位检测线8包被有L-FABP抗体，检测线两边分别设有控制线9,所述偶合物垫 片2上涂布有金标记的L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。优选地，所述 控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。所述胶体金试 纸还包括一外壳10,所述外壳包裹所述试纸，露出样本垫片3、硝酸纤维素膜1上的检测线 8和两条控制线9、以及吸水垫4。按以下步骤进行检测：1)收集的病人尿液样品，如低温保 存样品需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片3上，反应。3)判读，将所述胶体金试 纸置于多功能免疫检测仪，SSJ-2或MINI (瑞莱生物工程(深圳）有限公司）中判定结果。
【权利要求】
1. 一种快速定量检测L-FABP的胶体金试纸，包括支撑垫片（5)，位于所述支撑垫片 上的硝酸纤维素膜（1)，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫（4)，另一端连接偶合物垫片 (2)，所述偶合物垫片连接样本垫片（3)，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件 (7)，上方设有第二固定部件￠)，其特征在于，所述硝酸纤维素膜（1)中间部位检测线（8) 包被有L-FABP抗体，检测线两边分别设有控制线（9)，所述偶合物垫片（2)上涂布有金标 记的L-FABP单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物，所述控制线（9)包被有抗DNP抗 体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。
2. 如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于，所述第一固定部件（7)为双面胶，第 二固定部件（6)为单面胶。
3. 如权利要求1-2中任一项所述的胶体金试纸，其特征在于，所述胶体金试纸外还包 括一外壳（10)，所述外壳包裹所述胶体金试纸外，露出样本垫片（3)、硝酸纤维素膜（1)上 的检测线（8)和两条控制线（9)、以及吸水垫（4)。
4. 如权利要求3所述的胶体金试纸，其特征在于，所述两条控制线（9)与检测线（8)为 平行设置。
【文档编号】G01N33/68GK203881772SQ201420117615
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年3月14日 优先权日:2014年3月14日
【发明者】赵俊平, 刘红剑, 何晓红, 杨柳 申请人:瑞莱生物工程（深圳）有限公司