专利名称：胶体金免疫渗滤定量检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及临床免疫诊断试剂及其制备方法，具体涉及胶体金免疫渗滤技术及其
定量方法。
背景技术：
1971 年，Faulk 和 Taylor (Immunochem,8 :1081,1971)首先使用免疫胶体金作为标记物用于免疫电镜技术，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法得到了广泛的应用。用还原法可方便地从氯金酸制备各种不同粒径的胶体金颗粒，Frens介绍的方法最为常用(Nature (Phys. Sci. )241 :20，1973)，以柠檬酸三钠为还原剂得到的l(T70nm胶体金是临 床诊断试剂中最经常用的大小范围，粒径大小可由柠檬酸三钠的加入量准确决定。胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附能力，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、激素、病毒或细菌抗原等非共价结合，形成免疫胶体金缀合物，用于免疫检测。免疫胶体金技术在中国卫生部高等医药院校规划教材“免疫学和免疫学检验”(陶义训主编，第二版，北京，人民卫生出版社，1997)中已列为一个章节，该章节具体介绍了免疫胶体金在医学检验中最常使用的二个方法1)胶体金免疫渗滤试验，和2)胶体金免疫层析试验。目前常用的胶体金免疫诊断检测试纸有免疫层析试纸，可以达到定量或定性检测(如中国专利申请CN10125640A和美国专利US5753517)。胶体金免疫渗滤也是一种成熟的技术，目前在市场上有多家厂商生产的多种不同检测物的诊断试剂盒供应，其中大部分为定性试剂盒，即只能区分阴性和阳性，定量试剂盒目前主要由Axis-Shield公司生产的Nycocard和上海奥普生物医药有限公司生产的U2及其配套试剂盒，Qpad及其配套试剂盒，定量实现的检测技术为单点光反射法和CCD图像处
理方法。但是，目前采用胶体金免疫渗滤法进行检测也存在问题由于原料(硝酸纤维素膜，吸水垫)，样本粘度，温度，加样量的偏差等都会引起反应误差，一般的误差CV约10%左右，误差更大时会达到15%。现有的控制手段为原料质量控制(硝酸纤维素膜和吸水垫筛选符合定量要求的批号)和工艺优化(硝酸纤维素膜浸泡、喷涂等手段预处理等)。但是现有的技术中，检测结果变异大，只能被动的利用原料筛选和增加预处理工艺来解决这些问题，费时费力，效率低，成本高，还不能完全解决问题。因此，需要对现有技术作出改进，提供一种新的试纸和检测方法，以降低胶体金免疫渗滤法检测时的误差。
发明内容
本发明旨在提供一种胶体金免疫渗滤检测试剂盒和利用胶体金免疫渗滤法定量检测抗原抗体的方法，可降低误差。本发明的技术方案是，在胶体金免疫检测反应板上增加I或2个质控线或质控点，其中质控线或质控点为含量已知的待检测物标准样品。因为在同一次反应中，检测线(点)显色深浅的变化与质控线(点)显色深浅的变化呈有意义的相关性，利用质控线(点)来校正检测线(点)的偏差，可以有效克服由于原料(硝酸纤维素膜、吸水垫)、样本粘度、温度、加样量的偏差等引起的变异。如检测物为CRP蛋白(C反应蛋白)，就使用已知浓度的CRP蛋白纯品(如I-IOmg/L和50-150mg/L)包被于膜上质控线位置。检测时使用专用定量读数仪(如检测吸光度或CCD数值的仪器)同时读取检测线和质控线的吸光值或CCD灰度值，经数据处理得出仪器内部值。使用7 11点定标确定曲线，根据拟合曲线经公式计算，将仪器内部值在专用读数仪屏幕上转化后直接输出浓度值。技术方案为一种胶体金免疫渗滤定量检测方法，包括以下步骤( I)在胶体金免疫渗滤检测试剂盒的检测线或检测点上包被一抗；并设置一个或两个质控线或质控点，在质控线或质控点上含有与待测样品相同的、含量已知的标准样品； 所述的一抗为单克隆抗体、多克隆抗体或抗原；所述的待测样品包括CRP、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、白蛋白(ALB)、血浆D-二聚体(DD)、结核分枝杆菌抗体(TB)、淀粉样蛋白(SAA)、心肌肌钙蛋白I (cTnl)。(2)胶体金免疫渗滤检测试剂盒中加入待测样品和金标液，金标液中含有标记的二抗的胶体金；所述的二抗为单克隆抗体、多克隆抗体或抗原；所述的胶体金粒径为15 60nm ；(3)洗涤后，同时读取试纸上检测线或检测点和质控线或质控点的吸光度或(XD，根据标准曲线确定浓度；所述标准曲线的拟合方法为，用不同浓度的待测样品标准品溶液滴加到胶体金免疫渗滤检测试纸上，再加入金标液，洗涤后，读取检测线或检测点和质控线或质控点的吸光度或CXD ;用下列公式计算修正R=T/(C1*C2)或者 R=T/C其中T为检测线或检测点的吸光度或CCD读数，Cl和C2分别为两个质控线或质控点的读数；c为质控点或质控线为一个时的读数。本发明还提供了一种胶体金免疫渗滤定量检测试剂盒，包括检测线或检测点，以及一个或两个质控线或质控点；检测线或检测点上包被一抗；质控线或质控点包被与待测样品相同的标准样品。 本方法可以用于检测CRP、人绒毛膜促性腺激素(HCG )、白蛋白(ALB )、血浆D- 二聚体(DD)、结核分枝杆菌抗体(TB)、淀粉样蛋白(SAA)、心肌肌I丐蛋白I (cTnl)等抗体抗原。本发明的有益效果和优越性为，(I)检测的质量得到提升。现有的技术中，每人份之间的变异大，平均为CV〈15%，采用本方法后后CV降至〈10%。(2)产率提高现有技术只能被动的利用原料筛选和增加预处理工艺来解决这些问题，而且费时费力效果也不好；运用本发明后大大减轻原料的质量要求和预处理的工艺要求，大大提升生产效率，降低成本，而且质量水平显著提升。经过校正后，质量提升，对原料选择的要求可以降低，对原料预处理的工序可以大大简化。
图I为实施例2中，不同浓度CRP标准样品溶液与对应的定量读数仪器及其内部读数处理值的曲线。
具体实施例方式实施例I制备检测CRP的胶体金免疫渗滤试剂盒(I)反应板的制备a.将吸水垫，硝酸纤维素膜和塑料外壳装配成空白反应板。塑料外壳中央有一个圆孑L。b.包被在塑料外壳圆孔内的硝酸纤维素膜指定位置喷点质控线1，检测线，质控 线2。检测线上包被CRP抗体(一抗)，浓度为O. 1-2. Omg/ml ;质控线I和质控线上包被CRP标准样品，浓度为O. 1-2. Omg/ml ；c.干燥37度干燥2 24小时，冷却后装入铝箔袋，加入一袋干燥剂，封口。(2)胶体金标记a.将待标记的CRP单克隆抗体(二抗)标记于平均粒径为15飞Onm的胶体金颗粒上，离心去除上清液，沉淀用O. 2 O. 5%的PEG (分子量15000 20000)离心洗涤I次，用PH7. 2 7. 6的缓冲液(含1%BSA)浓缩至原体积的1/10 1/5，4度保存备用。b.调配用PH7. 2 7. 6的缓冲液(含1%BSA)，根据CRP系列标准品(浓度为Omg/L，lmg/L, 3mg/L, I Omg/L, 20mg/L, 40mg/L, 60mg/L, 80mg/L, lOOmg/L, 120mg/L)制备曲线，每个浓度做3次，确定稀释度，稀释后即为金标液。一般金标液中抗体含量为0. 01-0. 2mg/ml。(3)其它组分洗涤液ΡΗ7· 2 7. 6的PB缓冲液，表面活性剂(0. 05%_0· 5%)。实施例2用实施例I所得到的试剂盒进行检测。取不同浓度的CRP标准样品溶液来进行试验，方法是将不同浓度的CRP标准样品溶液(5、10、25、50、100、150和200mg/L)3 μ I与200 μ I金标液充分混匀后，取120 μ I混合液滴加在试纸的圆孔内硝酸纤维素膜上，待完全渗入后，先后加洗涤液和封闭液。将试剂盒放入定量读数仪器，同时读取检测线、质控线I和质控线2的CCD灰度值。用下列公式计算R=T/ (C1*C2)，或者 R=T/C其中T、C1和C2分别为检测线、质控线I和质控线2的仪器内部读数(在只有一个质控线的情况下，质控线的仪器内部读数为C)。取每个浓度下的R=T/(C1*C2)的平均值与浓度作图(只有一个质控线的情况下，取R=T/C数值)，结果如图I和表I所示。图I中，Y为C蛋白浓度，X为公式中的R，即机器内部读数的处理值。表I
权利要求
1.一种胶体金免疫渗滤定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (I)在胶体金免疫渗滤检测试剂盒的检测线或检测点上包被一抗；并设置一个或两个质控线或质控点，在质控线或质控点上含有与待测样品相同的、含量已知的标准样品； (2 )胶体金免疫渗滤检测试剂盒中加入待测样品和金标液，金标液中含有标记的二抗的胶体金； (3)洗涤后，同时读取试纸上检测线或检测点和质控线或质控点的吸光度或CCD，根据标准曲线确定浓度； 所述标准曲线的拟合方法为，用不同浓度的待测样品标准品溶液滴加到胶体金免疫渗滤检测试纸上，再加入金标液，洗涤后，读取检测线或检测点和质控线或质控点的吸光度或CXD ;用下列公式计算修正 R=T/(C1*C2)或者 R=T/C 其中T为检测线或检测点的吸光度或CCD读数，Cl和C2分别为两个质控线或质控点的读数；c为质控点或质控线为一个时的读数。
2.权利要求I所述胶体金免疫渗滤定量检测方法，其特征在于，所述的一抗为单克隆抗体、多克隆抗体或抗原。
3.权利要求I所述胶体金免疫渗滤定量检测方法，其特征在于，所述的二抗为单克隆抗体、多克隆抗体或抗原。
4.权利要求I所述胶体金免疫渗滤定量检测方法，其特征在于，所述的待测样品选自CRP、HCG、ALB、DD、TB、SAA、cTnl。
5.权利要求I所述胶体金免疫渗滤定量检测方法，其特征在于，所述的胶体金粒径为15 60nmo
6.一种胶体金免疫渗滤定量检测试剂盒，其特征在于，包括检测线或检测点，以及一个或两个质控线或质控点；检测线或检测点上包被一抗；质控线或质控点包被与待测样品相同的标准样品。
全文摘要
本发明涉及临床免疫诊断试剂及其制备方法，公开了一种胶体金免疫渗滤定量检测试剂盒和利用胶体金免疫渗滤法定量检测抗原抗体的方法。在胶体金免疫检测试试剂盒上增加1或2个质控线或质控点，其中质控线或质控点上含有含量已知的待检测物。因为在同一次反应中，检测线(点)显色深浅的变化与质控线(点)显色深浅的变化呈有意义的相关性，利用质控线(点)来校正检测线(点)的偏差，可以有效克服由于原料(硝酸纤维素膜、吸水垫)、样本粘度、温度、加样量的偏差等引起的变异。
文档编号G01N33/558GK102879562SQ201210370409
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者龚杰 申请人:上海奥普生物医药有限公司