一种快速定量检测mpo的胶体金试纸的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种快速定量检测MPO的胶体金试纸，所述胶体金试纸包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4，另一端连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件7，上方设有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位检测线8包被有MPO抗体，检测线两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的MPO单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。
【专利说明】一种快速定量检测MPO的胶体金试纸
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于临床医学诊断领域，具体涉及一种用于定量检测ΜΡ0(髓过氧化物 酶）的胶体金试纸。
【背景技术】
[0002] ΜΡ0 (髓过氧化物酶）是一种血色素蛋白，分子质量118kDa，含一对重链和轻链，它 存于嗜中性多核细胞的嗜天青颗粒和巨嗜细胞中，其功能是可将氯化物和过氧化氢转变为 次氯酸盐。在炎症状态下，它被释放入细胞外液进入循环，因此被认为是一种杀菌的酶，在 人体的天然防御、免疫功能方面起重要作用。此酶还参与含低密度脂蛋白的脂氧化。以邻 位二氨基苯胺盐酸盐为底物加过氧化氢可定量血中和组织中的酶活性。ΜΡ0能氧化低密度 脂蛋白胆固醇（LDLC)，从而有利于巨噬细胞摄取LDLC并转变为泡沫细胞；能氧化高密度脂 蛋白（HDL)，使其失去正常的功能；另外，ΜΡ0可激活金属蛋白酶、使粥样硬化斑块表面不稳 定趋于破裂；同时ΜΡ0还催化消耗内皮衍生的一氧化氮（N0)，从而减少N0的生物利用度， 损害N0的血管扩张和抗炎功能。
[0003] 急性冠状动脉综合征（ACS)以冠状动脉循环中血小板激活和聚集为特征，粥样硬 化斑块破裂或糜烂处的血栓形成和血小板聚集物对远端血管的栓塞，最终导致心肌细胞坏 死。形成冠心病的重要病理基础是动脉粥样硬化，以脉粥样硬化作为一种慢性炎症过程，动 脉壁中脂质、炎症细胞和坏死物质聚集为主要特征。粥样斑块的形成机制、并发症及其早期 检测指标一直是临床研究的热点。坏死心肌细胞释放的肌I丐蛋白（cardiac troponin，cTn) 已经成为对ACS患者进行危险分层、选择治疗方案的重要参考指标。但是，越来越多的证据 表明，心肌细胞损伤不仅与血小板激活有关，而且多形核中性粒细胞的募集和激活更加先 于血小板的变化。多形核中性粒细胞在ACS患者的冠状动脉循环中存在着明显的脱颗粒现 象，释放出大量的ΜΡ0(髓过氧化物酶），导致不稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者的血浆 ΜΡ0水平升高。炎症在动脉粥样硬化的发生、发展中占有重要的地位，ΜΡ0(髓过氧化物酶） 是由活化的中性粒细胞、单核细胞和部分巨噬细胞分泌的，是中性粒细胞活化的标志物。 ΜΡ0(髓过氧化物酶）及其氧化产物具有促进动脉粥样硬化的作用，并参与斑块的不稳定， 与急性冠状动脉综合征的发生密切相关。因此，ΜΡ0水平可以独立预测心血管疾病的危险 性，急性胸痛患者血中ΜΡ0水平的升高，可以预测未来6个月内发生心肌梗塞及其他严重心 血管疾病的危险性。更有意义的是，对于肌I丐蛋白I (Troponin I)及肌|丐蛋白T (Troponin T)等常规检测为阴性的患者，ΜΡ0水平的升高可以预测发生心梗等严重心血管疾病的危险 性。
[0004] 免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志 物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuC14)在还原剂如 白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成 为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正 电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体 金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合。根据胶体金的一些物理性 状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶 体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0005] 目前，检测ΜΡ0 (髓过氧化物酶）的方法目前主要是酶联免疫技术（ELISA)，ELISA 技术存在以下缺点：检测设备要求高，成本高；干扰因素较多，重复性不好；检测时间长。因 此酶联免疫技术检测ΜΡ0(髓过氧化物酶）不适合临床快速诊断。鉴于目前尚无快速的定 量检测方法，本实用新型的目的是提供一种可用于快速定量检测ΜΡ0 (髓过氧化物酶）的胶 体金试纸以及一种可用于快速定量检测ΜΡ0 (髓过氧化物酶）的胶体金试纸盒，所述胶体金 试纸和胶体金试纸盒具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点。 实用新型内容
[0006] 本实用新型的一个目的是提供一种快速定量检测ΜΡ0 (髓过氧化物酶）的胶体金 试纸，本实用新型所述快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸具有方便快捷、操作简单、结果准确 等优点，适于临床快速检测。
[0007] 本实用新型的技术方案是：
[0008] -种快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸，包括支撑垫片5,位于所述支撑垫片上的硝 酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4,另一端连接偶合物垫片2,所述偶合 物垫片连接样本垫片3,所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件7,上方设有第二 固定部件6,其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位检测线8包被有ΜΡ0抗体，检测线两 边分别设有控制线9,所述偶合物垫片2上涂布有金标记的ΜΡ0单克隆抗体或多克隆抗体以 及控制线偶合物。
[0009] 优选地，所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶 体金。BSA是牛血清白蛋白。
[0010] 优选地，所述第一固定部件7为双面胶，第二固定部件6为单面胶。
[0011] 优选地，所述两条控制线9与检测线8为平行设置。
[0012] 本实用新型的另一个目的是提供了一种快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸盒，在本 实用新型所述的定量检测ΜΡ0的胶体金试纸的基础上还包括一外壳10。
[0013] 所述外壳优选塑料外壳。
[0014] 所述外壳包裹所述试纸，露出样本垫片3、硝酸纤维素膜1上的检测线8和两条控 制线9、以及吸水垫4。
[0015] 本实用新型所述的试纸盒具有方便携带和贮存的优点。
[0016] 本实用新型所述的快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸或试纸盒的工作原理是：采用 双向侧流免疫反应原理，通过双抗体夹心法制备而成。检验时样本中的ΜΡ0抗原首先与偶 合垫上的ΜΡ0抗体偶合物发生免疫反应，形成免疫复合物。其后免疫复合物随着样本在硝 基纤维素膜上层析流动，当免疫复合物层析至硝基纤维素膜上的检测区（ΜΡ0检测线）时， 与预先包被在硝基纤维素膜上的抗ΜΡ0抗体发生反应从而被固定在硝基纤维素膜的检测 线上。血液中的ΜΡ0越多，检测线上的复合物越多，条带上的光密度值就越高。同时，在检 测过程中，控制线偶合物（即DNP-BSA标记的胶体金)，也会随样本在硝基纤维素膜上层析， 当层析至硝基纤维素膜的控制线时，DNP-BSA胶体金会与预先包被在硝基纤维素膜上的抗 DNP抗体发生反应从而被固定在对照区(控制线)上。由于胶体金为红色，因而固定在硝基纤 维素膜控制线上的抗DNP中的DNP-BSA胶体金免疫复合物将显示红色。当样本中不含MPO 时，则只显示两条控制线。当样本含MPO时，检测线就会清晰的显示出来。
[0017] 当反应结束后，利用多功能免疫检测仪（瑞莱生物工程(深圳）有限公司）将控制 线和检测线的光密度进行分析，并将所分析得到的结果进行运算，从而得到相对光密度值 (RI)。然后检测仪根据已预先设置在检测仪内的标准曲线对ΜΡ0的浓度进行计算并显示结 果，以pmol/L为单位表示。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是本实用新型所述快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸的一种优选实施方式的结 构示意图。
[0019] 其中，1:硝酸纤维素膜，2 :偶合物垫片，3:样本垫片，4:吸水垫，5:支撑垫片，6: 单面胶，7:双面胶，8:检测线，9:控制线。
[0020] 图2是本实用新型所述快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸盒的一种优选实施方式的 示图。
[0021] 其中，3:样本垫片，8:检测线，9:控制线，4:吸水垫，10 :外壳。
【具体实施方式】
[0022] 以下结合附图对本实用新型所述快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸或试纸盒进行 详细说明，不能理解为是对本实用新型的限制。以下实施例中所使用的材料和试剂除特别 说明外，均为普通市售。
[0023] 【实施例1】制备快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸
[0024] 如图1所示的胶体金试纸结构，包括支撑垫片5,位于所述支撑垫片上的硝酸纤维 素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端上方层叠连接吸水垫4,另一端上方层叠连接偶合物垫片 2,所述偶合物垫片远离硝酸纤维素膜1的一端上方层叠连接样本垫片3,所述样本垫片另 一端部的下方粘接双面胶7,上方粘接单面胶6,其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位 检测线8包被有ΜΡ0抗体，检测线两边分别设有控制线9,所述偶合物垫片2上涂布有金标 记的ΜΡ0单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。
[0025] 所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。
[0026] 其中，硝酸纤维素膜1在胶体金试纸中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的 发生处；检测线8是将ΜΡ0抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释到0. 5mg/ml的浓度，取lul/ cm划线于所述硝酸纤维素膜1上，37°C过夜干燥及60°C烘烤3天，即得；控制线9是将抗 DNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释到0. 5mg/ml的浓度，取lul/cm划线于所述硝酸纤 维素膜1上，37°C过夜干燥及60°C烘烤3天，即得。
[0027] 其中，所述偶合物垫片2的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片 的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液(包含〇. 1-1%的酪蛋白，〇. 5-5%的牛血清白蛋白、 0. 005-0. 5%的硼酸、0. 01-0. 2%的PEG)中浸泡5分钟后取出，37°C干燥后，用Biodot包膜 仪器将金标记的ΜΡ0单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物涂布在偶合物垫片2上， 涂布量是lul/mm，干燥，即得。优选地，所述偶合物垫片2的预封闭缓冲液包含0. 8%的酪蛋 白，4%的牛血清白蛋白，0. 007%的硼酸，0. 1%的PEG。
[0028] 其中，所述样本垫片3可对液态样品起到初步过滤作用。将样本垫片用141封闭 液(包含：〇. 1-1%的Tris，0. 1-1%的酪蛋白，0. 05-0. 5%的鼠抗人红细胞）浸泡5分钟后，过 夜37°C干燥，即得。优选地，所述141封闭液包含：0. 3%的Tris，0. 8%的酪蛋白，0. 3%的鼠 抗人红细胞。
[0029] 将上述各组成部件按图1所示结构粘贴在支撑垫片5上，获得快速定量检测ΜΡ0 的胶体金试纸。
[0030] 【实施例2】用本实用新型所述胶体金试纸快速定量检测ΜΡ0
[0031] 取本实用新型优选的一种快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸，如图1所示，所述胶体 金试纸包括支撑垫片5,位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端 上方层叠连接吸水垫4,另一端上方层叠连接偶合物垫片2,所述偶合物垫片远离硝酸纤维 素膜1的一端上方层叠连接样本垫片3,所述样本垫片另一端部的下方粘接双面胶7,上方 粘接单面胶6,其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位检测线8包被有ΜΡ0抗体，检测线 两边分别设有控制线9,所述偶合物垫片2上涂布有金标记的ΜΡ0单克隆抗体或多克隆抗体 以及控制线偶合物。优选地，所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA 标记的胶体金。按以下步骤进行检测：1)抽取的病人血清、血浆或全血等待检样本，如低温 保存样本需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片3上，反应。3)判读，将所述胶体金 试纸置于多功能免疫检测仪，SSJ-2或MINI (瑞莱生物工程(深圳）有限公司）中判定结果。
[0032] 【实施例3】用本实用新型所述胶体金试纸盒快速定量检测ΜΡ0
[0033] 取本实用新型优选的一种快速定量检测ΜΡ0的胶体金试纸盒，如图1和图2所示， 所述胶体金试纸包括支撑垫片5,位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素 膜的一端连接吸水垫4,另一端连接偶合物垫片2,所述偶合物垫片连接样本垫片3,所述样 本垫片另一端部的下方粘接双面胶7,上方粘接单面胶6,其特征在于，所述硝酸纤维素膜1 中间部位检测线8包被有ΜΡ0抗体，检测线两边分别设有控制线9,所述偶合物垫片2上涂 布有金标记的ΜΡ0单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物。优选地，所述控制线9包 被有抗DNP抗体,所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。所述胶体金试纸还包括一 外壳10,所述外壳包裹所述试纸，露出样本垫片3、硝酸纤维素膜1上的检测线8和两条控 制线9、以及吸水垫4。按以下步骤进行检测：1)抽取的病人血清、血浆或全血等待检样本， 如低温保存样本需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片3上，反应。3)判读，将所述 胶体金试纸置于多功能免疫检测仪，SSJ-2或MINI (瑞莱生物工程(深圳）有限公司）中判 定结果。
【权利要求】
1. 一种快速定量检测MPO的胶体金试纸，包括支撑垫片（5)，位于所述支撑垫片上的硝 酸纤维素膜（1)，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫（4)，另一端连接偶合物垫片（2)，所 述偶合物垫片连接样本垫片（3)，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件（7)，上 方设有第二固定部件（6)，其特征在于，所述硝酸纤维素膜（1)中间部位检测线（8)包被有 MP0抗体，检测线两边分别设有控制线（9)，所述偶合物垫片（2)上涂布有金标记的MP0单 克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物，所述控制线（9)包被有抗DNP抗体，所述控制线 偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。
2. 如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于，所述第一固定部件（7)为双面胶，第 二固定部件（6)为单面胶。
3. 如权利要求1-2中任一项所述的胶体金试纸，其特征在于，所述胶体金试纸外还包 括一外壳（10)，所述外壳包裹所述胶体金试纸外，露出样本垫片（3)、硝酸纤维素膜（1)上 的检测线（8)和两条控制线（9)、以及吸水垫（4)。
4. 如权利要求3所述的胶体金试纸，其特征在于，所述两条控制线（9)与检测线（8)为 平行设置。
【文档编号】G01N33/68GK203881771SQ201420113007
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】赵俊平, 刘红剑, 黄华都, 彭晓倩 申请人:瑞莱生物工程（深圳）有限公司