专利名称：一种双指标检测用胶体金试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于临床医学检验领域，具体涉及一种双指标检测用胶体金试纸条及其制 备方法。
背景技术：
为满足生物医药检测领域的快速检测要求，采用胶体金制备的检测试纸条及试剂 盒已经广泛应用。但是，由于一个试剂条只能检测一个指标，而实践中，往往需要同时检测 多个指标，采用多个单项检测的试剂盒和试剂条分别操作就显的繁琐费时。为了解决上述问题，中国专利(专利号01242327. 0)公开了一种多联的试剂盒， 可放置多条试剂条，用于同时检测几个指标。但是，该试剂盒结构较复杂，往加样孔加样时 也容易污染环境及双手。而且目前还没有一种能够同时检测N-端脑利钠肽前体和心肌肌 钙蛋白I的方法或者手段。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种双指标检测用胶体金试纸 条，可以解决现有技术存在的不能在一个试纸条中同时检测两个指标的问题。本发明的另一目的是提供该试纸条的制备方法。本发明的目的可通过采用以下技术方案予以实现一种双指标检测用胶体金试纸条，包括试纸条底衬，以及试纸条底衬上顺次相互 搭接粘贴的样品垫、涂覆有金标抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸，包被膜上设有包被兔抗鼠 IgG抗体的控制线，包被膜还设有与所述的控制线平行的两条检测线，分别包被能与待检抗 原之一特异结合的抗体；所述金标抗体有两种，分别为胶体金标记的能与待检抗原之一特 异结合的抗体。所述的与待检抗原之一特异结合的抗体为能够与待检抗原之一特异结合的单克 隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体。所述的两条检测线中一条包被N-端脑利钠肽前体多克隆抗体，另一条包被心肌 肌钙蛋白I单克隆抗体。所述的金标抗体为胶体金标记的N-端脑利钠肽前体单克隆抗体和胶体金标记的 心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。一种双指标检测用胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤1)制备包被膜用包被缓冲液分别稀释能与待检抗原之一特异结合的抗体以及 兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜的中部上，三种抗 体渗入硝酸纤维素膜后分别形成两条检测线和兔抗鼠IgG抗体包被的控制线；2)制备涂覆金标抗体的聚酯膜分别制备两种胶体金标记的能与待检抗原之一 特异结合的抗体，利用这两种抗体混合物涂覆聚酯膜；3)组装试纸条在试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴样品垫、涂覆有金标抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸。步骤1)所述的制备包被膜用包被缓冲液稀释N-端脑利钠肽前体多克隆抗体、心 肌肌钙蛋白I单克隆抗体以及兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于硝 酸纤维素膜的中部上，三种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成包被N-端脑利钠肽前体多 克隆抗体的检测线、包被心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线和兔抗鼠IgG抗体的控制线。步骤2、所述的制备涂覆金标抗体的聚酯膜的方法是将胶体金调节为碱性条件 下，加入链亲和素溶液，封闭反应后，加入接有生物素的抗体反应，离心去上清，沉淀以金标 抗体保存液恢复体积。所述的接有生物素的抗体优选接有生物素的N-端脑利钠肽前体单 克隆抗体或接有生物素的心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。本发明所述的双指标检测胶体金试纸条在同时检测两种待测抗原中的应用。本发明所述的双指标检测胶体金试纸条在同时检测N-端脑利钠肽前体和心肌肌 钙蛋白I中的应用。本试纸条可以用来检测心肌肌钙蛋白I和N-端脑利钠肽前体的液体样品，操作 时，将全血或血浆，血清按一定的量滴加在本试纸条的样品垫上，当出现的结果是在试纸条 的N-端脑利钠肽前体检测线、心肌肌钙蛋白I检测线和控制线位置上各出现一条紫红色条 带时，表现为两者都是阳性。心肌肌钙蛋白I检测线和控制线各出现一条红色条带，说明心 肌肌钙蛋白I为阳性；N-端脑利钠肽前体检测线和控制线各出现一条红色条带，说明N-端 脑利钠肽前体为阳性；仅试纸条的控制线8位置上出现一条紫红色条带时，为阴性结果；在 试纸条的控制性8位置上未出现紫红色条带时为无效结果。有益效果本发明采用了现代POCT检测中最流行的胶体金技术，通过试纸条上同时设置包 被有N-端脑利钠肽前体多克隆抗体的检测线、包被有心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线 和兔抗鼠IgG抗体的控制线，能够同步检测两个指标(待测抗原或蛋白)，并且两种抗原不 会相互干扰，结果准确，快速，操作简便，可以广泛的应用于心肌损伤，心肌梗死及心衰的同 时检测使用。
图1本发明的胶体金试纸条的横断面结构示意图；其中1.底衬；2.样品垫；3.聚酯膜；4.包被膜；5.吸水纸；6.包被N-端脑利钠 肽前体多克隆抗体的检测线；7.包被心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线8.包被兔抗鼠 IgG抗体的控制线。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。实施例1如图1所示，一种胶体金试纸条，包括试纸条底衬1，以及试纸条底衬上顺次相互 搭接粘贴的样品垫2、涂覆金标抗体的聚酯膜3、包被膜4和吸水纸5，包被膜4中部有一条 包被羊抗N-端脑利钠肽前体多克隆抗体的检测线6、一条包被心肌肌钙蛋白I单克隆抗体 4C2的检测线7和一条包被兔抗鼠IgG抗体的控制线8。以上抗体除了 N-端脑利钠肽前体多克隆抗体购自南京强欣生物技术有限公司，其它都是购自Fitzgerald公司。涂覆金标抗体的聚酯膜中有由胶体金颗粒标记的N-端脑利钠肽前体单克隆抗体 M907241和由胶体金颗粒标记的心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体M155。胶体金试纸条的具体制备方法如下1)包被膜4的制备a)包被缓冲液的制备将0. 025M, PH7. 4的PBS，用0. 22u膜过滤，置于4°C备用，
有效期7天。b)封闭液的制备将含1% BSA，蔗糖，0. 025M，PH7. 5的PBS，用0. 22U膜过滤，
置于4°C备用，有效期为3天。c)N-端脑利钠肽前体多克隆抗体检测线6的制备将羊抗N-端脑利钠肽前体多 克隆抗体按ang/ml的浓度，蠕动泵授液量0. ^il/min，划线速度50m/20min，在干燥箱内 20°C鼓风干燥12小时。d)心肌肌钙蛋白I单克隆抗体检测线7的制备将心肌肌钙蛋白I单克隆抗体4C2 按4. 5mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0. 4ml/min,划线速度50m/20min，在硝酸纤维膜中部上 划线，该线与检测线6平行，两线相隔4mm，细致均勻在干燥箱内20°C鼓风干燥12小时。e)控制线8的制备将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0. 4ml/ min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维膜上部划线，该线与检测线7平行，两线相隔4mm，细 致均勻，放入干燥箱内20°C鼓风干燥12小时。f)用上述封闭液将含有检测线6、检测线7和控制性8的硝酸纤维素膜于37°C封 闭60分钟，取出后置37°C下烘干处理两个小时，封袋备用。2)涂覆金标抗体的聚酯膜3的制备a)氯金酸水溶液的配制将IOg氯金酸IOOOml的三蒸水溶解，配成1 %的水溶液，
置于4°C备用，有效期3个月。b)柠檬酸三钠的配制用三蒸水溶解柠檬酸三钠，配成的水溶液，用0. 22U膜 滤过，置于4°C备用，有效期7天。c) 碳酸钾水溶液的配制将Ig碳酸钾用IOOml用三蒸水溶解，用0. 22U膜滤 过，置于4°C备用，有效期为7天。d)金标抗体保存液的配制将15g的蔗糖，20ul的叠氮钠，在IOOml的PH = 7. 4 的BSA溶解，用0. 22U膜滤过，置于4°C备用，有效期为7天。e)胶体金的颗粒的制备用三蒸水将1 %氯金酸稀释成0.01%，置于95°C反应10 分钟，加入Iml柠檬酸三钠，继续反应15分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却后 加入aiill1^碳酸钾溶液备用。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。f)金标抗体的制备用1 %碳酸钾溶液调节胶体金PH值至7. 5，按照IOug链亲和 素溶液/ml胶体金的量加入链亲和素溶液充分混勻，置于25°C水浴反应30分钟后再加入 5%BSA，封闭20分钟后，离心取沉淀，用BSA恢复其终浓度为1%，4°C保存备用。按50ug 单抗-生物素/ml胶体金的量将N-端脑利钠肽前体单克隆抗体M907M1-生物素加入胶体 金中，37°C搅拌反应40分钟，加入5% BSA,封闭搅拌20分钟，6000r/min离心20分钟，弃上 清，沉淀以金标抗体保存液恢复体积，4°C保存。金标心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体M155按 上述方法制备。将两种金标抗体按1 1混合，4°C保存。
g)将混合好的胶体金均勻的铺在聚酯膜上，喷量为1.0ul/Cm*3道，干燥，封袋，备用。3)样品垫2的处理将样品垫用IOOmM PBS缓冲液浸泡数小时，取出干燥后。4)胶体金试纸条的组装底衬1，样品垫2和吸水纸5是本领域通用的部件。将上述样品垫2、涂覆有金标 抗体的聚酯膜3、包被膜4及吸水纸5顺次相互搭接粘贴得到试纸板，最后将试纸板切割成 不同宽度的试纸条即可。实施例2N-端脑利钠肽前体(NT-proBNP)血样试验经罗氏E170化学发光仪配套本发明检测试剂盒测定含有不同定值的N-端脑利钠 肽前体的血清标本，比较显色程度与参考血清的差异，结果见表1。表 权利要求
1.一种双指标检测用胶体金试纸条，包括试纸条底衬，以及试纸条底衬上顺次相互搭 接粘贴的样品垫、涂覆有金标抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸，包被膜上设有一条包被兔抗 鼠IgG抗体的控制线，其特征在于包被膜还设有与所述的控制线平行的两条检测线，分别 包被能与待检抗原之一特异结合的抗体；所述金标抗体有两种，分别为胶体金标记的能与 待检抗原之一特异结合的抗体。
2.根据权利要求1所述的双指标检测胶体金试纸条，其特征在于所述的与待检抗原之 一特异结合的抗体为能够与待检抗原之一特异结合的单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段 或嵌合抗体。
3.根据权利要求1所述的双指标检测胶体金试纸条，其特征在于所述的两条检测线中 一条包被N-端脑利钠肽前体多克隆抗体，另一条包被心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的双指标检测胶体金试纸条，其特征在于所述的金标抗体为胶 体金标记的N-端脑利钠肽前体单克隆抗体和胶体金标记的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体。
5.一种权利要求1所述的一种双指标检测用胶体金试纸条的制备方法，其特征在于包 括如下步骤1)制备包被膜用包被缓冲液分别稀释能与待检抗原之一特异结合的抗体以及兔抗 鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜的中部上，三种抗体渗 入硝酸纤维素膜后分别形成两条检测线和兔抗鼠IgG抗体包被的控制线；2)制备涂覆金标抗体的聚酯膜分别制备两种胶体金标记的能与待检抗原之一特异 结合的抗体，利用这两种金标抗体混合物涂覆聚酯膜；3)组装试纸条在试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴样品垫、涂覆有金标抗体的聚酯 膜、包被膜及吸水纸。
6.根据权利要求5所述的一种双指标检测用胶体金试纸条的制备方法，其特征在于步 骤1)所述的制备包被膜用包被缓冲液稀释N-端脑利钠肽前体多克隆抗体、心肌肌钙蛋白 I单克隆抗体以及兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜 的中部上，三种抗体渗入硝酸纤维素膜厚分别形成包被N-端脑利钠肽前体多克隆抗体的 检测线、包被心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线和兔抗鼠IgG抗体的控制线。
7.根据权利要求5所述的一种双指标检测用胶体金试纸条的制备方法，其特征在于步 骤2)所述的制备涂覆金标抗体的聚酯膜的方法是将胶体金调节为碱性条件下，加入链亲 和素溶液，封闭反应后，加入接有生物素的抗体反应，离心去上清，沉淀以金标抗体保存液 恢复体积。
8.根据权利要求7所述的一种双指标检测用胶体金试纸条的制备方法，其特征在于所 述的接有生物素的抗体为接有生物素的N-端脑利钠肽前体单克隆抗体或接有生物素的心 肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。
9.权利要求1所述的双指标检测胶体金试纸条在同时检测两种待测抗原中的应用。
10.权利要求1所述的双指标检测胶体金试纸条在同时检测N-端脑利钠肽前体和心肌 肌钙蛋白I中的应用。
全文摘要
本发明属于临床医学检验领域，具体涉及一种双指标检测用胶体金试纸条及其制备方法。一种双指标检测用胶体金试纸条，包括试纸条底衬，以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、涂覆有金标抗体的聚酯膜、包被膜及吸水纸，包被膜上设有一条包被兔抗鼠IgG抗体的控制线，包被膜还设有与所述的控制线平行的两条检测线，分别包被能与待检抗原之一特异结合的抗体；所述金标抗体有两种，分别为胶体金标记的能与待检抗原之一特异结合的抗体。本发明试纸条能够同步检测两个指标，结果准确，特异性高，操作简便。
文档编号G01N33/577GK102103143SQ20111004487
公开日2011年6月22日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者王勇, 王路海, 苏恩本, 陈伟 申请人:南京基蛋生物科技有限公司