一种犬弓形虫感染胶体金检测试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种检测犬弓形虫感染胶体金试纸条及其制备方法，是通过克隆、表达纯化SAG3重组蛋白，制备并纯化单克隆抗体，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对42#抗弓形虫SAG3单克隆抗体标记，制备金标垫，组装试纸条，29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体作为检测线、羊抗鼠抗体作为质检线。制备的犬弓形虫感染检测胶体金试纸条具有快捷、便于操作、不需要特殊仪器等特点，检测结果清晰，可以较快的进行判断，并能区分是既往感染还是现症感染，适合于临床现场的快速诊断和牧区等大规模流行病学调查。
【专利说明】
一种犬弓形虫感染胶体金检测试纸条及其制备方法
技术领域
[0001]本发明提供一种胶体金检测试纸条，用于犬弓形虫感染循环抗原(CAg)的检测，本发明还公开了上述试纸条的制备方法，属于血清学检测技术领域。
【背景技术】
[0002]弓形虫属于细胞内寄生虫，能感染绝大多数的脊椎动物，是一种人兽共患寄生虫。犬是弓形虫的中间宿主之一。弓形虫在犬组织内进行无性繁殖，当弓形虫侵入免疫力正常犬机体时，虫体在犬体内缓慢形成可寄生长达终生的包囊。只有当受感染犬免疫力低下时，体内的弓形虫便趁机迅猛繁殖，从而引发其全身性的感染，不仅造成犬机体严重受损，也使得与患病犬亲密接触的人群和公共环境遭受弓形虫的侵染和破坏。建立快速、敏感和特异的检测方法具有重要意义。SAG3蛋白在弓形虫的各个时期表达，用于诊断弓形虫病时则能较为全面的检测各个阶段的弓形虫感染。目前尚未见利用SAG3蛋白进行犬弓形虫检测研究的相关研究。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是公开一种检测犬弓形虫循环抗原(CAg)胶体金试纸条，解决了当前犬弓形虫感染缺乏理想检测方法问题。
[0004]本发明还提供了上述试纸条的制备方法，适用于工业化生产。
[0005]本发明检测试纸条的制备方法如下:
本发明检测弓形虫CAg胶体金检测试纸条，是以本实验室制备的42#抗弓形虫SAG3单抗(单克隆细胞抗体效价为204800，亚类为Gl)为捕获抗体标记胶体金制作金标垫，以29#抗弓形虫SAG3单抗(单克隆细胞抗体效价为204800，亚类为G2a)包被硝酸纤维膜(NC膜)作为检测线(T)，用羊抗鼠抗体作为质控线(C)。
[0006]本发明用42#抗弓形虫SAG3单抗作为捕获抗体，用29#抗弓形虫SAG3单抗为检测抗体，能特异性的检测出犬血清中是否含有弓形虫CAg。用两株单抗制备出胶体金试纸条，保留了其特异性强的特点，并增强了其灵敏度高、稳定性。
[0007]本发明弓形虫CAg检测胶体金试纸条的积极效果在于:检测特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简单、易于判断和保存，且无需任何仪器设备等优点并能区分是既往感染还是现症感染。适合于临床的快速诊断和基层等应用。
[0008]本发明涉及的一种检测犬弓形虫感染胶体金试纸条，主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板;其特征在于:
金标垫上的金标抗体为42#抗弓形虫SAG3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的指示线T线包被29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体、C线包被羊抗鼠抗体，建立了一种双抗体夹心胶体金试纸条检测方法。
[0009]本发明涉及的一种检测犬弓形虫感染胶体金试纸条的制备方法，是通过克隆、表达纯化SAG3重组蛋白，制备并纯化单克隆抗体，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对42#抗弓形虫SAG3单克隆抗体标记，制备金标垫，组装试纸条，29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体作为检测线、羊抗鼠抗体作为质检线，其中:
一、弓形虫SAG3基因的克隆、表达及纯化
1、SAG3基因的引物设计与合成根据GenBank中弓形虫的SAG3基因序列设计一对特异的寡核苷酸引物。
[0010]上游引物:5-TATGAATTCGAGCACGGACTGTTCGTC-37下游引物:5-ATAAAGCTTTTAGGCAGCCACATGCACAAG-37。
[0011]2、SAG3基因的PCR扩增及产物回收
以弓形虫cDNA为模板，进行体外扩增。按小量胶回收试剂盒说明(TAKARA)进行PCR产物回收。
[0012]3、SAG3基因的表达及鉴定
将纯化的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接，转化至大肠杆菌DH5a感受态中。后将已经鉴定的阳性重组质粒，胶回收目的片段并进行纯化，转化至DH5a感受态，在含Kan的LB琼脂平板上涂板，挑取单个菌落，菌液培养，提取质粒，进行酶切鉴定。
[0013]4、SAG3基因在大肠杆菌中表达及鉴定
将SAG3基因经IPTG诱导表达。进行SDS-PAGE鉴定。利用8M尿素纯化SAG3蛋白。经Western blot分析得知该重组蛋白可被犬弓形虫阳性血清识别，具有良好的反应原性。
[0014]二、抗弓形虫SAG3蛋白单克隆抗体的制备
1、动物免疫
利用纯化后的弓形虫SAG3蛋白按60yg蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只BALB/c雌性小鼠。之后每隔13-15天进行一次加强免疫，共三次。免疫量为30yg蛋白/只。最后一次加强免疫10天后，利用间接ELISA方法测定免疫小鼠的抗体效价。
[0015]2、骨髓瘤细胞与脾细胞融合
取处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞进行融合。
[0016]3、阳性杂交瘤细胞株的筛选
用间接ELISA方法进行抗体的检测，筛选阳性杂交瘤细胞并进行克隆。
[0017]4、单克隆细胞亚型鉴定
利用抗体亚型鉴定试剂盒，对单克隆抗体进行亚型鉴定。结果单抗的29#亚类均为G2a，42#亚类为Gl。
[0018]5、单克隆抗体的大量制备将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔，收集腹水。
[0019]三、胶体金试纸条的制备
硝酸纤维素膜21mm，样品垫24mm、金标垫9mm、吸水纸32mm从下到上依次粘贴于PVC底板上，样品垫压金标垫2mm，金标垫压NC膜2mm，吸水纸压NC膜2mm;依次粘贴好后，用切纸机将组装的试纸板切成每条宽度为4mm的试纸条，T线包被29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体、C线包被羊抗鼠抗体即可。
[0020]本发明的积极效果在于:
制备的犬弓形虫感染检测胶体金试纸条具有快捷、便于操作、不需要特殊仪器等特点，检测结果清晰，可以较快的进行判断，并能区分是既往感染还是现症感染，适合于临床现场的快速诊断和牧区等大规模流行病学调查。
[0021 ]高特异性和敏感性:本发明用42#抗弓形虫SAG3单抗作为捕获抗体，用29#抗弓形虫SAG3单抗为检测抗体，能特异性的检测出犬血清中是否含有弓形虫CAg。用两株单抗制备出胶体金试纸条，保留了其特异性强的特点，并增强了其灵敏度、稳定性。
【附图说明】
[0022]图1胶体金试纸条T线条件的确定图2胶体金试纸条C线条件的确定；
图3胶体金试纸条的特异性试验；
图4胶体金试纸条的敏感性试验；
图5胶体金试纸条的批内重复性试验；
图6胶体金试纸条的批间重复性试验；
图7胶体金试纸条的稳定性试验。
【具体实施方式】
[0023]下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。
[0024]实施例1
犬弓形虫感染检测胶体金试纸条的制备
(I)胶体金的烧制
采用柠檬酸钠还原法，量取99 mL四蒸水加入到硅化过的锥形瓶中，放入磁力搅拌转子，调节磁力加热搅拌器，使转子勾速转动，保持恒定高温。当观察到瓶底开始起气泡时，加Al %的氯金酸溶液I mL，调节搅拌旋钮至适当转速，让搅拌转子的速度降至沸腾的液面不打漩涡，避开易出漩涡的中间部位迅速加入2.6 mL的1%柠檬酸三钠，随后可观察到淡黄色的氯金酸水溶液很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约6 min，继续煮沸15 min，冷却后用去离子水补足体积至100 mL。即制备出30nm胶体金颗粒。
[0025](2)金标抗体最佳pH确定
用0.2 mo I/L K2CO3结合精密pH试纸调节胶体金溶液pH依次为3.0-10.0，每隔I个pH值为一个检测梯度。每管加入2.73 !^/!^的单抗3.7 nL，在振荡器上混匀，室温下放置30分钟。观察胶体金颜色变化，记录保持和空白对照颜色一致的最低PH，即为最佳的标记pH。
[0026](3)金标抗体的制备
将最适K2⑶3的量加入胶体金溶液，再对42#抗弓形虫SAG3单抗进行标记，标记后的金标抗体溶解于复溶液中，混匀后即为金标抗体，将其滴加于金标垫上。
[0027](4) NC膜上T线单抗包被浓度的确定
将T线29#抗弓形虫SAG3单抗稀释成1、0.5、0.25、0.125yg/yL，每个试纸条包被0.8仙，按照常规条件进行操作，观察T线的显色情况，确定T线单抗的最佳包被浓度。
[0028](5) NC膜上C线羊抗鼠抗体包被浓度的确定
将C线羊抗鼠抗体稀释成1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被0.8 yL，按照常规条件进行操作，观察结果C线的显色情况，确定C线羊抗鼠抗体的最佳包被浓度。
[0029]、结果 (I)胶体金的烧制
胶体金溶液颜色均匀透明，透射电镜观察颗粒大小基本一致，约30 nm左右，分散均匀，没有聚集，可用于下一步试验。
[0030](2)金标抗体最佳pH确定
确定胶体金标记抗体的最适0.2 mol/L K2CO3加入量为4 yL。
[0031](3)金标抗体的制备
通过透射电镜观察，金颗粒周围有一圈蛋白晕，分散性较好，无聚集现象，表明标记成功。
[0032](4)NC膜上T线单抗最佳包被浓度的确定
29#抗弓形虫SAG3单抗浓度稀释到0.5 yg/yL时T线显色仍较为明显，故选择0.5 yg/yL为T线最佳包被浓度(见图1)。
[0033](5) NC膜上C线抗体最佳包被浓度的确定
结果显示当羊抗鼠抗体浓度稀释到0.5 yg/yL包被时C线显色最明显，故选择0.5 yg/μL为C线最佳包被浓度(见图2 )。
[0034]实施例2胶体金免疫层析试纸条性能测试
为了测试试纸条的试验性能，需要进行一系列的试验，其中包括特异性试验、敏感性试验、重复性试验、保存期试验。
[0035](I)特异性试验
分别取犬弓形虫感染参考阳性血清、犬心丝虫、犬蛔虫、犬等孢球虫、犬巴贝斯虫阳性血清，按照常规方法进行操作，判断各种血清之间有无交叉反应，从而评价试纸条的特异性(见图3)。
[0036](2)敏感性试验
将犬弓形虫感染参考阳性血清(1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、)，按常规操作观察试纸条显色情况。当用肉眼无法观察到T线，并且C线依旧清晰可见时，此时的稀释度即为该方法的最低检出浓度(见图4)。
[0037](3)重复性试验 I)批内重复性试验
取犬弓形虫感染参考阳性血清，同一批试纸条，对3份参考阳性血清样品进行检测，每个样品重复检测I次，根据试纸条显色情况，确定该方法的重复性情况。
[0038](2)批间重复性试验
取犬弓形虫感染参考阳性血清，3批试纸条，对3份参考阳性血清样品进行检测，每个样品重复检测2次，根据试纸条显色情况，确定该方法的重复性情况。
[0039](4)稳定性试验
将试纸条密封保存分别于4°C、37°C、室温。分别在7 d、15 d两个时间点对犬弓形虫感染参照阳性血清进行检测，观察三种环境各试纸条的显色情况，从而判断试纸条检测的稳定情况。
[0040](5)试纸条的初步应用
用胶体金试纸条方法检测76份待检犬血清样本(均来自长春地区某宠物医院)。
[0041]、结果 (1)特异性试验
结果只有犬弓形虫参照阳性血清T线显色，犬心丝虫、犬蛔虫、犬等孢球虫、犬巴贝斯虫阳性血清T线均无显色，表明无交叉反应，特异性良好。(见图3)
(2)敏感性试验
结果1:64倍稀释时T线仍有显色，所以该试纸条敏感性为1:64。(见图4)
(3)重复性试验
I)批内重复性试验:同一批试纸条，对3份犬弓形虫参考阳性血清样品进行检测，每个样品重复检测I次，试纸条的检测结果相一致(见图5)。
[0042]2)批间重复性试验:3批试纸条，对3份犬弓形虫参考阳性血清样品进行检测，每个样品重复检测2次，检测试纸条的诊断结果相一致(见图6)。
[0043]说明该方法具有可重复性。
[0044](4)保存期试验
结果表明将试纸条密封保存分别于4°C、37°C、室温时，于15 d后依旧能够显示正确结果，T/C线显色情况均也无太大区别，说明该试纸条至少可以存放15 d以上(见图7)。
[0045](5)胶体金试纸条的初步应用
应用已经建立的胶体金试纸条检测方法，76份待检犬血清样本(均来自长春地区某宠物医院)。结果显示有4份血清样品检测为阳性，所以检出率为5.26%(4/76)。
【主权项】
1.一种检测犬弓形虫感染胶体金试纸条，主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板;其特征在于: 金标垫上的金标抗体为42#抗弓形虫SAG3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的指示线T线包被29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体、C线包被羊抗鼠抗体。2.如权利要求1所说的一种检测犬弓形虫感染胶体金试纸条的制备方法，通过克隆、表达纯化SAG3重组蛋白，制备并纯化单克隆抗体，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对42#抗弓形虫SAG3单克隆抗体标记，制备金标垫，组装试纸条，29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体作为检测线、羊抗鼠抗体作为质检线，其中: 弓形虫SAG3基因的克隆、表达及纯化 I )SAG3基因的引物设计与合成 根据GenBank中弓形虫的SAG3基因序列设计一对特异的寡核苷酸引物； 上游引物:5-TATGAATTCGAGCACGGACTGTTCGTC -37 ； 下游引物:5-ATAAAGCTTTTAGGCAGCCACATGCACAAG-37 ； . 2) SAG3基因的PCR扩增及产物回收 以弓形虫cDNA为模板，进行体外扩增;进行PCR产物回收； . 3)SAG3基因的表达及鉴定 将纯化的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接，转化至大肠杆菌DH5a感受态中；后将已经鉴定的阳性重组质粒，胶回收目的片段并进行纯化，转化至DH5a感受态，在含Kan的LB琼脂平板上涂板，挑取单个菌落，菌液培养，提取质粒，进行酶切鉴定； . 4 ) SAG3基因在大肠杆菌中表达及鉴定 将SAG3基因经IPTG诱导表达;进行SDS-PAGE鉴定;利用8M尿素纯化SAG3蛋白； 经Western blot分析得知该重组蛋白可被犬弓形虫阳性血清识别，具有良好的反应原性； 抗弓形虫S AG 3蛋白单克隆抗体的制备 1)动物免疫 利用纯化后的弓形虫SAG3蛋白按60yg蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只BALB/c雌性小鼠；之后每隔13-15天进行一次加强免疫，共三次;免疫量为30yg蛋白/只；最后一次加强免疫10天后，利用间接ELISA方法测定免疫小鼠的抗体效价；. 2)骨髓瘤细胞与脾细胞融合 取处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞进行融合；. 3)阳性杂交瘤细胞株的筛选 用间接ELISA方法进行抗体的检测，筛选阳性杂交瘤细胞并进行克隆；. 4)单克隆细胞亚型鉴定 利用抗体亚型鉴定试剂盒，对单克隆抗体进行亚型鉴定； 结果单抗的29#亚类均为G2a，42#亚类为Gl ；. 5)单克隆抗体的大量制备 将杂交瘤细胞接种小鼠腹腔，收集腹水； 胶体金试纸条的制备 硝酸纤维素膜21mm，样品垫24mm、金标垫9mm、吸水纸32mm从下到上依次粘贴于PVC底板上，样品垫压金标垫2mm，金标垫压NC膜2mm，吸水纸压NC膜2mm;依次粘贴好后，用切纸机将组装的试纸板切成每条宽度为4mm的试纸条，T线包被29#抗弓形虫SAG3单克隆抗体、C线包被羊抗鼠抗体即可。
【文档编号】G01N33/577GK106018817SQ201610382820
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】张西臣, 宋慧琦, 杨升, 高珺珊, 李建华, 宫鹏涛, 寇金华, 杨举, 李 赫, 李棕松, 杨正涛, 尹继刚
【申请人】吉林大学