免疫胶体金渗滤法定量检测生物样品中抗原性物质的方法和试剂盒的制作方法
【专利说明】免疫胶体金渗滤法定量检测生物样品中抗原性物质的方法 和试剂盒
[0001] 本发明的技术领域
[0002] 本发明涉及生物化学和光电检测领域，更特别地涉及一种利用免疫胶体金渗滤法 定量检测生物样品中抗原性物质的方法及试剂盒。
[0003] 本发明的【背景技术】
[0004] 胶体金免疫层析技术和胶体金免疫渗滤技术是近代医学检验史上革命性技术，基 于这两种技术开发的产品如早孕检测试纸条，各种病毒检测试纸条，毒品检测试纸条等，已 广泛应用于临床医学检验。这些试纸条具有快速、简易、方便等优势，使得床边医学检验成 为可能。但这些试纸条最大的缺陷就是只能进行定性检测而不能定量，因此，这些产品只能 起到初筛的作用。如果能进行准确定量，则这些产品不仅可以帮助诊断，而且还可以帮助疗 效的确定和预后的判断（曹丹如，陈悦，刘德琮等，快速检测血清HCG的半定量金免疫渗滤 法的建立.检验医学，2008, 23(1) :8-10 ;邵强，王俊华，双抗体夹心ELISA法测定残余汉逊 酵母菌体蛋白含量的研究.四川动物，2008, 27(5) :945-946)。
[0005] C-反应蛋白（C-reactiveprotein)是炎性淋巴因子白介素-6、白介素-1、肿瘤坏 死因子刺激肝脏上皮细胞合成的。由各种原因引起的组织损伤都会导致血清中C-反应蛋 白浓度的升高，同时还会出现一系列的全身性反应，包括发热、免疫反应增强等急性时相反 应。C-反应蛋白水平的高低与炎症的出现及其严重程度具有线性相关性，因而被公认为是 最有价值的急性时相反应蛋白，且它的升高可以提示许多炎症性疾病的发生。
[0006] 国内外现有检测C-反应蛋白的方法有金标层析法、金标渗滤法、免疫浊度法。参 见例如，张晓慧、李光韬和张卓莉，C-反应蛋白与超敏C-反应蛋白的检测及其临床意义，中 华临床免疫和变态反应杂志.2011，01:80-85;杨世峰，尹爱萍.(：-反应蛋白与糖尿病肾病 的研究进展.医学综述.2008,03 :118-120 ;韩锋产，阎小君，侯瑜等.胶体金免疫层析法 检测抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A抗体.世界华人消化杂志.1999,9(7);邓艳琴，严 延生，何似等.应用快速免疫层析法检测恙虫病特异性IgM、IgG及总抗体.中国人兽共患 病杂，2003,06 :53-55 ;赵海峰，甘一如.胶体金免疫层析法检测小分子物质.农药，2007， 46(7) :439-446;朱明东，徐卫民，洪林娣等.斑点金免疫渗滤法快速诊断布鲁杆菌病的研 究.中国地方病学杂志，2006, 25(3) :326-327;杨溢，陈其云，杨扬.免疫比浊法测定血清 C-反应蛋白（C-反应蛋白）的评价.四川省卫生管理干部学院学报，2003,03:9-10。
[0007] 南京普朗医疗使用金标层析法检测C-反应蛋白，其通过使用配套仪器免疫定量 分析仪FIA8000,可以达到定量或非定量检测人血液中高敏C-反应蛋白的目的。该系统的 使用不需要抗凝剂，可以检测浓度在〇. 5~64mg/L范围内的血清或者血浆样品，但是无法 检测全血。另外，其可以储存10000个血清样本的检测值。检测一个血清样本操作过程需 要的时间是7分钟，并且待检时间严格控制在7分钟。当浓度< 20mg/L时CV< 15%，而当 浓度 > 20mg/L时CV彡 20%。
[0008] 芬兰Orion公司使用免疫比浊法检测C-反应蛋白。其通过使用配套仪器 QuikRead/第二代P0CT产品，可以定量测试血液中的C-反应蛋白，但是不能用于低浓度 C-反应蛋白的定量检测，例如新生儿诊断或心血管疾病危险分级。该系统使用EDTA或肝素 作为抗凝剂，可以检测浓度在8-160mg/L范围内的全血，但无法储存检测值。检测一个全血 样本的操作过程需要的时间是4分钟，并且待检时间严格控制在4分钟。在检测8mg/L浓 度时，CV< 15% (李亚，李忠，何晓明.超敏C-反应蛋白检测的临床应用.热带医学杂志， 2007,08 :85-86 ;王伟，何莹，韩起等.超敏C-反应蛋白单克隆抗体制备及其ELISA体系的 初步建立?免疫学杂志，2013,08:59-63)。
[0009] 挪威Axis-Shield公司使用金标渗滤法检测C-反应蛋白。其通过使用配套仪器 Nycocard/第二代P0CT产品，可以定量测试血液中的C-反应蛋白，但是不能用于低浓度 C-反应蛋白的定量检测，例如新生儿诊断或心血管疾病危险分级。该系统使用EDTA、肝素 或枸橼酸盐作为抗凝剂，可以检测浓度在8-250mg/L范围内的全血样品，但无法储存检测 值。检测一个全血样本操作过程需要的时间是4分钟，并且待检时间需要严格控制在5分 钟内，其量程范围内的CV< 5% (龙建国，张会峰，郑运周等.D-二聚体异常结果临床疾病 的调查分析?医学理论与实践，2010,07 :104-105)。
[0010] 在临床上，经常需要在短时间内同时对大批量的样品进行检测，但免疫胶体金方 法的检测时间上的限制影响了其在临床环境中的应用，特别是在检测人员和设备都相对较 少的基层临床医院，这一问题显得更为突出。因此，就需要一种能够具有满足临床检验需要 的更长待检时间范围的用于检测生物样品中抗原性物质的方法。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明提供了一种利用免疫胶体金渗滤法定量检测生物样品中抗原性物质的方 法，其中包括，将待测样品、结合有对所述抗原性物质特异性的第一抗体的胶体金与固定有 对所述抗原性物质特异性的第二抗体的检测板反应区相接触，紧接着将蛋白质固定剂与反 应区接触，随后通过光电检测装置检测反应区的光信号来确定样品中所述抗原性物质的存 在，并将所述抗原性物质以量化表达。
[0013] 本发明还提供蛋白质固定剂在制备用于检测生物样品中抗原性物质的试剂盒中 的用途。
[0014] 另一方面，本发明提供一种利用免疫胶体金渗滤法定量检测生物样品中抗原性物 质的试剂盒，其包含结合有对所述抗原性物质特异性的第一抗体的胶体金、固定有对所述 抗原性物质特异性的第二抗体的检测板反应区和蛋白质固定剂。
[0015] 发明详述
[0016] 本发明的方法可用于定性和定量地检测生物样品中的各种抗原性物质，例如现有 技术中已经利用免疫胶体法进行定性或定量检测的那些。以下以C-反应蛋白为例对本发 明的方法以及其他方面进行说明。
[0017] 本发明采用免疫胶体金渗滤法，可用于定量检测来自人或动物的样品中的C-反 应蛋白。例如用羊抗人多克隆C-反应蛋白抗体分别与硝酸纤维素膜和胶体金结合，因而 当检测时，样品中的C-反应蛋白抗原与硝酸纤维素膜上包被、胶体金标定的羊抗人多克隆 c-反应蛋白抗体结合，以形成"固相c-反应蛋白抗体-c-反应蛋白抗原-金标记C-反应 蛋白抗体"的双抗体夹心复合物而凝聚显色。由于不同样本中c-反应蛋白抗原浓度不一 样，最终显色会随着C-反应蛋白抗原浓度变大而加深，因此通过配套检测设备可以测出具 体的C-反应蛋白抗原浓度。通过这一方法，提高了检测样本的灵敏度和量程。
[0018] 另一方面，本发明利用蛋白质固定剂使蛋白质的水化层破坏从而导致其理化性质 改变和生物活性的丧失。而且，在检测板反应区最后加入蛋白质固定剂，使其在特定时间内 起到抗体-抗原蛋白反应终止固定的作用，使已结合的c-反应蛋白斑点牢牢固定在NC膜 上，从而极大的延长了C-反应蛋白待检时间。
[0019] 因此，本发明提供了一种利用免疫胶体金渗滤法定量检测生物样品中抗原性物质 的方法，其中包括，将待测样品和结合有对所述抗原性物质特异性的第一抗体的胶体金与 固定有对所述抗原性物质特异性的第二抗体的检测板反应区相接触，紧接着将蛋白质固定 剂与反应区接触，随后通过光电检测装置检测反应区的光信号来确定样品中所述抗原性物 质的存在和/或其浓度。
[0020] 在一个实施方式中，所述第一抗体为单克隆抗体。
[0021] 在一个实施方式中，所述第二抗体为多克隆抗体或不同于所述第一抗体的单克隆 抗体。
[0022] 或者，所述第一和第二抗体均为针对所述抗原性物质的多克隆抗体。
[0023] 本发明涉及的蛋白质固定剂可以是任何能够使得蛋白质变性并在胶体金免疫检 测用的固体载体上固定的物质。在一个实施方式中，所述蛋白质固定剂为醇类水溶液，其 可以是乙醇水溶液或其他的醇类（如甲醇、丙醇、丁醇等）水溶液；醇类水溶液的浓度可以 为 10-25 % (v/v)，例如，11 %、12 %、13 %、14 %、15 %、16 %、17 %、18 %、19