副溶血性弧菌免疫胶体金快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种副溶血性弧菌免疫胶体金检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，在硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，由保藏号为CGMCC No.8003的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3G9E9G3H7和胶体金结合后形成金标抗体，将所述的金标抗体喷涂于结合垫上形成金标垫，由保藏号为CGMCC No.9010的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3G9F7D5C9作为检测抗体，所述的检测抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线。本发明还提供了上述的胶体金检测试纸条在检测食品副溶血性弧菌的应用。本发明的副溶血性弧菌免疫胶体金检测试纸条具有检测特异性和灵敏性均较高的优点。
CGMCC No.8003
2013.07.16
CGMCC No.9010
2014.04.10
【专利说明】副溶血性弧菌免疫胶体金快速检测试纸条
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及一种免疫胶体金检测试纸条，具体来说是一种副 溶血性弧菌免疫胶体金快速检测试纸条。
【背景技术】
[0002] 在食品微生物检测中，检测副溶血性弧菌的含量是一个重要的食品安全指标。 2003?2004年的统计结果显示，我国食物中毒致病因素依次为微生物性、化学性、有毒动 植物性病原。微生物性病原是导致食物中毒的主要因素，中毒人数最多。食源性致病菌快 速检测一直是研究关注的焦点。
[0003] 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus)ATCC17802是一种革兰阴性嗜盐弧菌， 常存在于近海岸海水、海产品及盐渍食品中（如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，咸菜、腌肉 等），当人们食用被副溶血性弧菌污染的食物后，极可能会引起以腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发 热等为主要症状的急性肠胃炎。此外，重症患者还可出现脱水、休克昏迷，甚至死亡。1950 年日本首次发生严重的该病菌的食物中毒事件，当时统计共有272名患者中毒，其中有20 名死亡。直到1963年日本国立预防卫生研究所（今日本国立传染病研究所）的福见秀雄 和坂崎利一证明了此种细菌应属于弧菌属，将学名改定为副溶血性弧菌。在1971年美国由 海产品引发副溶血性弧菌食物中毒事件，发生于马里兰州，中毒人数达425人。我国在1962 年首次报道副溶血性弧菌，至今在上海、连云港、扬州、温州、香港等沿海城市有发生副溶血 性弧菌中毒事件，中毒人数多，但是死亡率不高。由于中毒事件频繁发生，必须要从源头上 控制，目前市场上有多种产品用于检测副溶血性弧菌ATCC17802,其中有一些是使用免疫胶 体金方法的试纸条，但是现有技术中的免疫胶体金试纸条所使用的抗体往往是使用单克隆 抗体作为金标抗体和多克隆抗体作为检测抗体配合使用，因此存在着检测精度低和交叉反 应高、试纸条有效期短等问题，对检测的精度和准确度造成了一些影响。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种副溶血性弧菌ATCC17802的免疫胶体金检测 试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密 相连，所述的金标垫和所述的硝酸纤维素膜紧密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸水 垫紧密相连，在所述的硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述的检测线接近所述的金标垫， 所述的检测线远离所述的金标垫的一侧的硝酸纤维素膜上设置有质控线，其中，由保藏号 为CGMCC No. 8003的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3G9E9G3H7和胶体金结合后形成金 标抗体，所述的金标抗体的pH范围为7. 0-7. 5,在所述的金标抗体中，所述的抗体的浓度 彡15 μ g/mL，所述的金标抗体喷涂于结合垫上形成金标垫，由保藏号为CGMCC No. 9010的 杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3G9F7D5C9作为检测抗体，所述的检测抗体喷涂于硝酸纤 维素膜上形成检测线。
[0005] 进一步的，所述的质控线由羊抗鼠抗体或者金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)抗体构 成。
[0006] 进一步的，所述的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫设置在一个底板上。
[0007] 另外，本发明还提供副溶血性弧菌ATCC17802的胶体金检测试纸条在检测食品副 溶血性弧菌ATCC17802中的应用。
[0008] 本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求 的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1是本发明实施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫胶体金检测试纸条的单抗 的 SDS-PAGE 电泳图，其中 Lanel :3G9F7D5C9, Lane2 :3G9E9G3H7。
[0010] 图2是本发明自制胶体金溶液的可见光吸收峰。
[0011] 图3是本发明自制胶体金溶液的zeta电位图。
[0012] 图4是本发明实施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫胶体金检测试纸条的各抗 体偶联胶体金PH结果。
[0013] 图5是本发明实施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫胶体金检测试纸条的各抗 体偶联胶体金结合量结果。
[0014] 图6是本发明实施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫胶体金检测试纸条的结构 示意图。
[0015] 图7是本发明实施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫胶体金检测试纸条的胶体 金试纸条灵敏度结果。
[0016] 图8是本发明实施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫胶体金检测试纸条的胶体 金试纸条交叉反应结果。
【具体实施方式】
[0017] 本发明人的研究表明，以副溶血性弧菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯 化得到两株抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9，其抗体效价可达到 1:100000,其能够特异性、高效地与副溶血性弧菌结合，与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒 沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠杆菌0157: H7、阪崎肠杆菌、小肠耶 尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计77种病原细菌均无交叉反应。
[0018] 抗体
[0019] 本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体可以利用小鼠杂交瘤细胞系 3G9E9G3H7(CGMCC No.8003)或 3G9F7D5C9(CGMCC No.9010)分泌产生。
[0020] 本发明包括具有抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的相应氨基 酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具 体地，本发明包括具有含超变区（互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质 偶联物及融合表达产物（即免疫偶联物及融合表达产物），只要该超变区与本发明的轻链 和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。如本领域技术人员所 知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和 其他诊断或治疗分子与抗副溶血性弧菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发 明还包括与抗副溶血性弧菌单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0021] 对于本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方 法测定。抗副溶血性弧菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区（complementarity determining region,⑶R)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本 发明包括那些具有带⑶R的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其⑶R与抗副溶血 性弧菌单克隆抗体⑶R具有90%以上（较佳地95%以上）的同源性。本发明不仅包括完 整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或（Fab ')2片段；抗体重链；抗 体轻链。
[0022] 本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以 用常规技术，利用杂交瘤细胞系3G9E9G3H7(CGMCC No. 8003)或3G9F7D5C9(CGMCC No. 9010) 获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
[0023] -旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0024] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0025] 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子（或如载 体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0026] 本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这 些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0027] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。
[0028] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl 2法 处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电 穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可运用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规 机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
[0029] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0030] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如 果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这 些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析（凝胶过 滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法 的结合。
[0031] 本发明的抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9,其效价高（可以达 到1:100000)，能够特异性地、高效地检测副溶血性弧菌，与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤 寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、大肠杆菌0157:H7、阪崎肠杆菌、小肠 耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等共计77种病原细菌均无交叉反应，此为本发明 的最大创新点。上述单克隆抗体3G9E9G3H7可以用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、纳米金 颗粒标记，专一性地作为检测抗体使用。上述单克隆抗体3G9F7D5C9在各种检测运用中，可 专一性地作为捕捉抗体使用。
[0032] 免疫胶体金检测试纸条
[0033] 本发明还提供了一种副溶血性弧菌ATCC17802的免疫胶体金检测试纸条，包括样 品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密相连，所述的金 标垫和所述的硝酸纤维素膜紧密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸水垫紧密相连，在 所述的硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述的检测线接近所述的金标垫，所述的检测线远 离所述的金标垫的一侧的硝酸纤维素膜上设置有质控线，其中，由保藏号为CGMCC No. 8003 的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3G9E9G3H7和胶体金结合后形成金标抗体，所述的金标 抗体的pH范围为7. 0-7. 5,在所述的金标抗体中，所述的抗体的浓度> 15 μ g/mL，所述的金 标抗体喷涂于结合垫上形成金标垫，由保藏号为CGMCC No. 9010的杂交瘤细胞株产生的单 克隆抗体3G9F7D5C9作为检测抗体，所述的检测抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线。
[0034] 较优选地，所述的质控线由羊抗鼠抗体或者金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)抗体构 成。
[0035] 较优选地，所述的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫设置在一个底板上。
[0036] 另外，本发明还提供副溶血性弧菌ATCC17802的胶体金检测试纸条在检测食品副 溶血性弧菌ATCC17802中的应用。
[0037] 本发明的副溶血性弧菌ATCC17802的免疫胶体金检测试纸条由于采用了新筛选 的配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果证实其对副溶血性弧菌ATCC17802 的检测特异性和灵敏性均较高。
[0038] 本发明的检测原理与结果判断过程为：若样本中有待测细菌，测定时样品处理液 加在样品垫上，样品处理液按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的方向移动，流经金标 垫时，使金标垫上的金标抗体复溶，并带动其向硝酸纤维素膜、吸水垫移动，金标抗体可与 样品中的细菌结合，形成免疫复合物，此免疫复合物流至检测线时，即被检测线的特异性固 相抗体所捕获，形成细菌+金标抗体+抗体的复合体，在硝酸纤维素膜上的检测线位置显出 红色检测线条；此免疫复合物流经质控线时，即被质控线的固相抗体或SPA所捕获，在硝酸 纤维素膜上的质控线位置显出红色质控线条。
[0039] 阳性标本既显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质控线。
[0040] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0041] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0042] 主要试剂
[0043] 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG、TWEEN-20Sigma ;BSA上海世泽生物科技 有限公司；胶体金溶液本实验室自制；硝酸纤维素膜（NC膜）135S Millipore ;羊抗鼠、 HRP-羊抗鼠、羊抗兔生工生物工程股份有限公司。
[0044] 主要仪器
[0045] 酶标仪 SpectraMax M2 购自 Molecular Devices ;Nanodrop 2000C 购自 Thermo Scientific ;点样仪AD6010购自BIO-DOT ;扫描仪Phantom V9购自MICROTEK ;恒温培养摇 床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogic? LP 358BR5057购自BI0-RAD;单人净化 工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
[0046] 实施例1抗副溶血性弧菌单克隆抗体3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的制备
[0047] 一、免疫原和阳性标准品的准备
[0048] 副溶血性弧菌（ATCC No. 17802)接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW)，37°C、 150r/min振荡培养17h，计数，加入0. 3%甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整副溶血 性弧菌（ATCC No. 17802)浓度至5 X 109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为IO8Cfu/ ml作为阳性对照标准品，3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW)为阴性对照标准品。
[0049] 二、单克隆抗体的制备
[0050] 1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0051] 2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射 一次。
[0052] 3)米血：3次加强免疫后从尾部静脉米血，米用间接非竞争酶联免疫法测定抗血 清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0053] 4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融 合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5% CO2培养箱培养。
[0054] 5)杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞， 将其转移至24孔培养板。
[0055] 6)克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔 底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 - 4次，直至阳性率达到 100 %。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6个 杂交瘤细胞，7?10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中 纯化抗体。
[0056] 三、单克隆抗体的效价测定
[0057] 副溶血性弧菌培养基如下：国标：GB/T 4789. 7-2008
[0058] 3 %氯化钠碱性蛋白胨水（APW)
[0059] 成分：蛋白胨10. 0g，氯化钠30. 0g，蒸馏水1000. OmL
[0060] 制法：将上述成分混合，调节pH8. 5±0. 2,121°C高压灭菌10min。
[0061] 单克隆抗体效价测定的步骤如下：
[0062] (1)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100 μ 1，4°C过夜（约包板 36h)。
[0063] (2)倒空液体并拍干残留液体，用250 μ 1洗涤液清洗3次。
[0064] (3)每个孔中加 100μ 11% BSA，37°C封闭 lh。
[0065] (4)倒空液体并拍干残留液体，用250 μ 1洗涤液清洗3次。
[0066] (5)每个孔中加100μ 1血清，37°C孵育lh。
[0067] (6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250 μ IPBST洗涤液洗涤3次。
[0068] (7)每个孔中50 μ 1的HRP标记的二抗（sigma)，室温孵育lh。
[0069] (8)用洗涤液浸泡5min，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250 μ IPBST洗涤 液洗涤3次。
[0070] (9)每个孔中加100 μ 1底物，显色30min，加终止液100 μ 1并立即在OD45tl读数。
[0071] 表L两株单克隆抗体效价测定结果（OD45tl)
[0072]
【权利要求】
1. 一种副溶血性弧菌免疫胶体金检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和 吸收垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密相连，所述的金标垫和所述的硝酸纤维素膜紧 密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸水垫紧密相连，在所述的硝酸纤维素膜上设置有 检测线，所述的检测线接近所述的金标垫，所述的检测线远离所述的金标垫的一侧的硝酸 纤维素膜上设置有质控线，其特征在于：由保藏号为CGMCC No. 8003的杂交瘤细胞株产 生的单克隆抗体3G9E9G3H7和胶体金结合后形成金标抗体，所述的金标抗体的pH范围 为7. 0-7. 5,在所述的金标抗体中，所述的抗体的浓度> 15 ii g/mL，所述的金标抗体喷涂 于结合垫上形成金标垫，由保藏号为CGMCC No. 9010的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体 3G9F7D5C9作为检测抗体，所述的检测抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线。
2. 如权利要求1所述的一种副溶血性弧菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于：所述 的质控线由羊抗鼠抗体或者金黄色葡萄球菌蛋白A构成。
3. 如权利要求1所述的一种副溶血性弧菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于：所述 的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫设置在一个底板上。
4. 权利要求1所述的副溶血性弧菌胶体金检测试纸条在检测食品副溶血性弧菌 ATCC17802中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK104316690SQ201410610331
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】刘箐, 李建武 申请人:上海理工大学