李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于：其中，由保藏号为CGMCCNo.8002的杂交瘤细胞株6D4H7C8B6产生的单克隆抗体作为金标抗体偶联胶体金，以及由保藏号为CGMCCNo.8765的杂交瘤细胞株1B4E7A6C9产生的单克隆抗体作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫上，检测抗体喷涂于NC膜上形成检测线。本发明对李斯特菌的检测特异性和灵敏性均较高。
【专利说明】李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物检测领域。具体而言，本发明涉及一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条。
【背景技术】
[0002]李斯特菌(Listeriaspp.)是一种短小的革兰氏阳性无芽胞兼性厌氧杆菌,共有单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytohenes)、绵羊李斯特菌(Listeria iuanuii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、默氏李斯特菌(Listeriamurrayi)七个菌株，其中单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是唯一对人致病的、典型的胞内寄生菌，可以导致严重的人畜共患传染病，如脑膜炎、败血症、流产和单核细胞增多等症状。1988年，世界卫生组织(World Health Organization, WHO)发表“食源性李斯特菌病劝告书”，指导全世界各国如何预防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成为新的重要的食源性疾病病原菌，WHO将其与E.coli0157、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。该菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香肠、加工禽类、生肉、鱼、虾、烟熏鱼、生蔬菜。
[0003]目前李斯特菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定的快速检测手段，但是检测产品全部依赖进口，我国目前尚无拥有完全自主知识产权，且可运用于检测实践的快速检测产品，该专利以李斯特菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及李斯特菌快速检测产品。
【发明内容】
[0004]为解决上述问题，本发明提供一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条。
[0005]一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于:
[0006]其中，由保藏号为CGMCCN0.8002的杂交瘤细胞株6D4H7C8B6产生的单克隆抗体作为金标抗体偶联胶体金，由保藏号为CGMCCN0.8765的杂交瘤细胞株1B4E7A6C9产生的单克隆抗体作为检测抗体，金标抗体偶联胶体金后喷涂于金标垫上，检测抗体喷涂于NC膜上形成检测线。
[0007]另外，本发明还提供了李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品中的李斯特菌中的应用。
[0008]发明作用与效果
[0009]根据本发明的李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条，由于采用了配对单克隆抗体分别喷涂金标垫和检测线，实验结果对李斯特菌的检测特异性和灵敏性均较高。【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是本发明实施例中单克隆抗体纯度测定的结果；
[0011]图2是本发明实施例中李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金的最佳pH的检测结果；
[0012]图3是本发明实施例中李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金的最佳结合量的检测结果；
[0013]图4是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的结构示意图；
[0014]图5是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体组合配对结果；
[0015]图6是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的灵敏度测定结果；
[0016]图7是本发明李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的交叉反应结果；以及
[0017]图8是本发明实施例中李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条的模拟带菌实验结果O
[0018]保藏信息
[0019]1.产生抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6D4H7C8B6于2013年07月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为CGMCCN0.8002。
[0020]2.抗单核细胞增生李斯特菌杂交瘤细胞1B4E7A6C9于2014年01月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为CGMCCN0.8765。
【具体实施方式】
[0021]本发明人的研究表明，以单核细胞增生性李斯特菌作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，分离纯化得到抗李斯特菌单克隆抗体1B4E7A6C9和6D4H7C8B6，其抗体效价可达到1:100000，其能够特异性、高效地与李斯特菌结合，与猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌等均无交叉反应。
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所使用的菌株，除提供保藏编号的两株外，其它菌株均可以通过商业渠道获得。
[0023]一、抗李斯特菌单克隆抗体的制备及鉴定
[0024]1.免疫原和阳性标准品的准备
[0025]单核细胞增生性李斯特菌(ATCCN0.43251)接种于李氏增菌肉汤37°C、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3%甲醛溶液室温灭活I天。用生理盐水调整单核细胞增生性李斯特菌(ATCC N0.43251)浓度至5 X 109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为IO8Cfu/ml作为阳性对照标准品，李氏增菌肉汤为阴性对照标准品。
[0026]2.单克隆抗体的制备过程
[0027](I)实验动物:选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。[0028](2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
[0029](3)采血:3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0030](4)细胞融合:取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50% PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5% CO2培养箱培养。
[0031](5)杂交瘤细胞筛选:采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。
[0032](6)克隆培养及抗体制备:用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 — 4次，直至阳性率达到100 %。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6个杂交瘤细胞，7~10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。
[0033]3.单克隆抗体纯化及鉴定
[0034]腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后,再用Protein G Sepharose亲和层析法纯化,将制备纯化所得抗体D3、E7、B9通过Nanodrop2000C测定仪测得浓度如表1，1B4E7A6C9浓度为4.5mg/ml,6D4H7C8B6浓度为3.8mg/ml，该浓度适于抗体的使用与保存，不需再进行浓缩或稀释。 [0035]纯化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价，结果见表2 ;再用SDS-PAGE分析纯度，5%积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像分析系统观察结果，结果如图1所示。图1中第I泳道是1B4E7A6C9，第二泳道是:6D4H7C8B6。
[0036]表1单克隆抗体的浓度
[0037]
【权利要求】
1.一种李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条，具有衬板，以及在衬板上依次排列的样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于: 其中，由保藏号为CGMCCN0.8002的杂交瘤细胞株6D4H7C8B6产生的单克隆抗体作为金标抗体偶联胶体金，由保藏号为CGMCCN0.8765的杂交瘤细胞株1B4E7A6C9产生的单克隆抗体作为检测抗体，所述金标抗体偶联胶体金后喷涂于所述金标垫上，所述检测抗体喷涂于所述NC膜上形成检测线。
2.如权利要求1所述的李斯特菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品中的李斯特菌中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK103941012SQ201410178017
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】刘箐, 李建武, 杨标 申请人:上海理工大学