空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种空肠弯曲菌，具体来说是一种空肠弯曲 菌免疫胶体金快速检测试纸条。
【背景技术】
[0002] 空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni enteritis)是 1973 年 Butzler 等自腹泻病 人粪便中分离出来，目前已认识其为人类腹泻的主要致病菌之一。空肠弯曲菌肠炎的发病 率在发达国家超过细菌性痢疾，在发展中国家发病率几乎等同于细菌性痢疾。本菌作为重 要的食源性致病菌，随着食物进入肠道后在含微量氧环境下迅速繁殖，主要侵犯空肠、回肠 和结肠，侵袭肠粘膜，造成充血及出血性损伤，近年来观察到有些菌株能产生类似霍乱肠毒 素，引起肠腔内液体分泌增加。
[0003] 目前空肠弯曲菌的检测主要依赖于国标所规定的生化鉴定，其缺点是操作繁琐、 检测周期较长，无法适应大量的样品筛查。免疫学检测是近年来出现的最快速、准确、稳定 的快速检测手段，但国内外目前尚无可运用于检测实践的快速检测产品。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速 检测试纸条，所述的这种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条解决了现有技术中检测空 肠弯曲菌操作复杂，周期长的技术问题。
[0005] 本发明提供了一种空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条，包括样品垫、金标垫、 硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密相连，所述的金标垫和所述的 硝酸纤维素膜紧密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸水垫紧密相连，所述的纤维素膜 上远离金标垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线，其中， 在所述的金标垫上设置有与胶体金耦联的单克隆抗体，所述的与胶体金耦联的单克隆抗体 由保藏号为CGMCC NO. 8457的杂交瘤细胞株分泌产生，所述的检测线由单克隆抗体构成，所 述的检测线的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO. 8766的杂交瘤细胞株分泌产生。
[0006] 进一步的，所述的质控线由羊抗兔抗体或者羊抗鼠抗体组成。
[0007] 进一步的，在所述的与胶体金耦联的单克隆抗体中，单克隆抗体与胶体金的质量 体积比为12 μ g: lmL。
[0008] 进一步的，检测线上单克隆抗体的浓度彡20 μ g/mL。
[0009] 进一步的，所述的试纸条背面可设置一个起支撑作用的背板。
[0010] 进一步的，所述的试纸条装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有 检测孔，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
[0011] 本发明还提供了上述空肠弯曲菌免疫胶体金快速检测试纸条在检测食品空肠弯 曲菌中的应用。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的单抗SDS-PAGE电 泳图；
[0013] 图2是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体 金pH结果；
[0014] 图3是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的各抗体偶联胶体 金结合量结果；
[0015] 图4是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的结构示意图；
[0016] 图5是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的不同抗体组合结 果；
[0017] 图6是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条灵 敏度结果；
[0018] 图7是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的胶体金试纸条交 叉反应结果；
[0019] 图8是本发明实施例中空肠弯曲菌的免疫胶体金检测试纸条的模拟带菌结果。
【具体实施方式】
[0020] 本发明的检测原理与结果判断过程为：若样本中有待测细菌，测定时样品处理液 加在样品垫上，样品处理液按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的方向移动，流经金标 垫时，使金标垫上的与胶体金耦联的单克隆抗体复溶，并带动其向硝酸纤维素膜、吸水垫移 动，与胶体金耦联的单克隆抗体可与样品中的细菌结合，形成免疫复合物，此免疫复合物流 至检测线时，即被检测线的单克隆抗体所捕获，形成细菌+金标抗体+抗体的复合体，在硝 酸纤维素膜上的检测线位置显出红色检测线条；此免疫复合物流经质控线时，即被质控线 的固相抗体所捕获，在硝酸纤维素膜上的质控线位置显出红色质控线条。阳性标本既显示 检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质控线。
[0021] 本发明的与胶体金耦联的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO. 8457的杂交瘤细胞株 分泌产生，所述的检测线的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO. 8766的杂交瘤细胞株分泌产 生。
[0022] 本发明包括具有与抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3、3G2D8H3G9的相应氨基 酸序列的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具 体地，本发明包括具有含超变区（互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质 偶联物及融合表达产物（即免疫偶联物及融合表达产物），只要该超变区与本发明的轻链 和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。如本领域技术人员所 知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和 其他诊断或治疗分子与抗空肠弯曲菌单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明 还包括与抗空肠弯曲菌单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0023] 对于本发明的抗空肠弯曲菌单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。 抗空肠弯曲菌单克隆抗体V链的超变区或互补决定区（complementarity determining region，⑶R)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些 具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与抗空肠弯曲菌单克隆抗 体⑶R具有90%以上（较佳地95%以上）的同源性。本发明不仅包括完整的单克隆抗体， 还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或（Fab '）2片段；抗体重链；抗体轻链。
[0024] 本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以 用常规技术，利用杂交瘤细胞系（CGMCC No. 8457)或（CGMCC No. 8766)获得。此外，还可将 轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
[0025] -旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0026] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0027] 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中己知的各种现有的DNA分子（或如载 体）和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0028] 本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这 些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0029] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。
[0030] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如出血性大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaClJi 处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使