甲拌磷胶体金检测卡的制作方法
【技术领域】
[0001]属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有害残留物的检测方法，特别是甲拌磷试纸检测方法。
【背景技术】
[0002]甲拌磷是有机磷类重要的杀虫杀螨剂，主要用来防治小麦、水稻、高粱、棉花等大田作物害虫，为土壤和种子的处理剂，是高等毒性，甲拌磷在植物体内氧化为更高毒性的氧化物，并有较长的残效期，对人类的健康存在潜在威胁，因此，对甲拌磷残留快速检测方法的研究具有一定意义。目前，常见的甲拌磷检测方法为气质联用法和液质联用法，由于常规仪器分析方法前处理复杂，费时费力，设备昂贵，需要专业人员操作，不适宜大量样品和现场快速检测。而本发明则研制出了一种方便现场检测、快速简便、成本低廉的检测卡检测方法。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供快速检测出植物源食品中甲拌磷的残留。
[0004]本发明的技术方案是甲拌磷的检测卡及其检测样品的处理方法。甲拌磷的检测卡是在长条扁平薄壳状的检测卡外壳内设置检测条，检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔，其特征在于测试条是由支承背板上粘贴四种原件组成:支承背板中部粘贴硝酸纤维素膜，支承背板一端上粘贴吸水纸，另一端粘贴样品垫，吸水纸内端与硝酸纤维素膜搭接，样品垫与硝酸纤维素膜之间则有一段金标垫，由金标垫将样品垫与硝酸纤维素膜连接在一起。金标垫中是含有第二种属动物蛋白和甲拌磷抗体的混合物，硝酸纤维素膜上横向有2条间隔开的显色印记带，一条是含甲拌磷蛋白质偶联物的检测带，另一条是第二种属动物蛋白的IgG (常用的为抗兔抗体或抗鼠抗体)；测试条置入检测卡外壳内，样品垫正对加样孔，硝酸纤维素膜正对检测窗孔。
[0005]样品处理方法是:称取Ig样品于50mL具塞锥形瓶中，精确至0.0lg。加入正己烷:乙酸乙酯混合溶剂1mL和内标工作液(灭蚁灵20 μ L，盖上瓶塞置于超声波发生器中，以40%输出功率超声提取30分钟。加入2g无水硫酸钠至锥形瓶中，盖上瓶塞充分振荡。将提取液全部转移至离心管中，在7000r/min条件下离心10分钟。取上清液5mL，上清液即为药物的抽提液。
[0006]本发明的优点是能快速检测出蔬菜中含有的甲拌磷，且节省检测成本，使用方便，检测快速，灵敏度高，结果准确。
【附图说明】
[0007]图1是甲拌磷检测卡外壳及检测试纸条在外壳内的安置图。
[0008]图2是甲拌磷检测卡检测试纸条结构示意图。
[0009]图3是检测试纸条硝酸纤维素膜上显示印迹带示意图。
【具体实施方式】
[0010]1.标记胶体金的制备
胶体金溶液的制备:先将I g氯金酸(HAuCl4)粉末溶于100 mL超纯水配置成1%的氯金酸溶液；再取I L超纯水于特质电炉上加热，至沸腾后加入10 mL 1%的柠檬酸三钠水溶液，沸腾后继续加热，5分钟后加10 mL 1%的氯金酸溶液，再次加热至沸腾，等待颜色变为酒红色后开始计时，10分钟后停止加热，取下后自然冷却、定容至I L，即为胶体金溶液。
[0011]抗体标记:确定抗体所需的0.1 mol/1 K2CO3的比例，取100 mL胶体金溶液，加入此比例0.1 mo I/L的K2CO3,混匀(约5 min),再将甲拌磷和第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01 mol/L, ρΗ7.4)溶解稀释至2 mg/mL,加入2 mL 2 mg/mL的甲拌磷抗体(或2 mL 2mg/mL第二种属动物蛋白),混勻(5 min),最后加入10% BSA 2 mL,混勻(5 min)。离心三次留沉淀，此三次收集的沉淀即为金标甲拌磷抗体。
[0012]胶体金标记部分处理:将甲拌磷抗体稀释后，按一定比例将载体(如玻璃纤维、聚酯膜等)浸透，铺均匀，取出放于37 °C恒温烘箱烘制8-12 h，干燥后即作为胶体金标记部分。
[0013]2.免疫层析专用高分子复合膜制备
首先用一种硝酸纤维素膜制成透明背衬膜，在背衬膜上覆盖一层对蛋白质结合力强，浸润性能好的具有一定孔径的层析膜。背衬膜的作用是阻止粘合剂中的有机溶剂对层析膜上蛋白质的破坏。
[0014]3.层析膜的点样方法
将一定浓度的甲拌磷抗原(甲拌磷与载体物质形成的偶合物)精确定量；以一定间距(5mm)呈横条状点定于层析膜上，供检测用。
[0015]甲拌磷检测卡是在检测卡外壳I中设置检测试纸条2，检测卡外壳I的结构及检测试纸条2的设置见附图1，检测卡外壳I为长条扁平薄壳状外壳，长70 mm，宽20 mm，厚5mm ,薄壳壁厚I mm ,由工程塑料制成,检测卡外壳I由上盖和下盖两半联接而成,在检测卡外壳I上盖上有检测窗孔3和加样孔4。检测试纸条2放置在检测卡外壳I的下盖内。
[0016]检测试纸条2是多层结构的窄条薄片,片长60 mm ,片宽约4 mm，厚度小于2.5mm。检测试纸条2是多层结构:底层是支承背板5,为聚乙烯薄片,厚度约0.5 mm ,长60mm ,宽4 mm ;支承背板5中部粘贴硝酸纤维素膜6 ,硝酸纤维素膜厚0.5 mm,长20 mm ,宽4 mm。硝酸纤维素膜6上有两条间隔开的横向显示印迹带，参见附图3，两条显示印迹中，一条是检测线10，含甲拌磷偶联物，另一条是参照线11，含第二种属动物蛋白的IgG。支承背板5 —端上粘贴吸水纸9，另一端粘贴样品垫8，吸水纸9内端与硝酸纤维素膜6搭接，样品垫8与硝酸纤维素膜6之间则有一段金标垫7，由金标垫7将样品垫8与硝酸纤维素膜6连接在一起，搭接宽度在1-2 mm。样品垫8材料为吸水玻璃纤维或聚酯膜。
[0017]使用甲拌磷胶体金检测卡时，先将待检测的样品液(药物的抽提液稀释后，直接用于检测)从加样孔4中滴入甲拌磷检测试纸条2的样品垫8，由于虹作用原理，带动待检测的样品液及胶体金膜7所含的抗甲拌磷单克隆抗体胶体金标记物一起向硝酸纤维素膜6扩散，5-10分钟内观察结果。
[0018]检测卡的主要反应是免疫学的抗原和抗体反应，在硝酸纤维素膜上迁移的胶体金标记的抗体，在测试线上与含有甲拌磷蛋白质偶联物，以及参照线含第二种属动物蛋白的IgG反应，形成棕红色条带。若样品中相应的待测甲拌磷高于允许值，样品加入后先与金标垫中的抗体反应，而不会与检测带所带有的甲拌磷蛋白质偶联物反应，从而不显色。主要有以下3种检测结果:
1.检测线10和参照线11同时显现棕红色印迹，表示检测结果为阴性，说明被测样品中不含甲拌磷或含量低于允许值；
2.检测线10不显色，参照线11显现棕红色印迹，表示检测结果为阳性，说明被测样品中甲拌磷含量高于允许值；
3.检测线10显现棕红色印迹，参照线11不显色，或检测线10和参照线11均不显色，表示检测试纸条失效。
【主权项】
1.甲拌磷胶体金检测卡，其特征在于:在试纸的背衬上依次贴有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分，胶体金标记部分被标记的物质为第二种属动物蛋白和甲拌磷抗体的混合物；检测反应部分包被有检测用甲拌磷抗原I条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG I条作为参照线。2.根据权利要求1所述的甲拌磷胶体金检测卡，其特征在于:甲拌磷检测用抗原为甲拌磷与载体物质形成的偶合物。3.根据权利要求2所述的甲拌磷胶体金检测卡，其特征在于:所述的载体物质，为蛋白质、蛋白质片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。4.根据权利要求1所述的甲拌磷胶体金检测卡，其特征在于:所述的第二种属动物蛋白为非抗体来源动物的蛋白质。
【专利摘要】本发明涉及甲拌磷胶体金检测卡。该方法在试纸的背衬上依次粘贴有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分。检测反应部分上面包被有检测用抗原1条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG1条作为参照线。该快速检测试纸条特异性强，能够半定量检测，环境温度为4-40℃都可以使用，适合于个体养殖户、食品卫生质检部门、海关等植物源食品进行甲拌磷残留的快速检测。本发明具有特异性强、灵敏性高、能够实现半定量检测，且操作简单方便等有益效果。
【IPC分类】G01N33/558
【公开号】CN105572350
【申请号】CN201410534144
【发明人】杜道林, 洪霞, 刘静
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月12日