一种人降钙素原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人降钙素原的检测方法，尤其涉及vde免疫检测试剂盒，属于生物领 域。
【背景技术】
[0002] 降钙素原（procalcitonin，PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质，分子质量为 13kD的糖蛋白，由116个氨基酸组成，包括N-残端、降钙素、下钙素三个部分，其中1~57 为N-残端，60~92为降钙素，96~116为下钙素。1996年以来，PCT作为一种新型的诊断 细菌感染以及其继发的合并症的鉴别诊断工具，在诊断败血症、败血症休克以及严重系统 炎症反应等此类疾病诊断以及过程的追踪观察方面，PCT诊断具有明显优势，且特异性高。 2001年国际脓毒症会议的脓毒症诊断标准已把PCT作为诊断指标之一。近年来PCT被认为 是系统性炎性反应综合征、脓毒症、急性呼吸窘迫综合征等疾病的预警指标，反映了全身性 细菌感染的存在和严重程度。
[0003] 在人体血液循环中，不仅存在全长的PCT多肽（约13kD)，而且源自于PCT多肽的 片段也广泛存在其中，具体来说，相关文献也讨论过降钙素部分上下游分别发生的蛋白水 解切割（Muller等，Crit Care Med2000 ;977_83 ;Whang等，J Clin Endocrinol Metabl998 ; 83 :3296-301)。然而，关于此的实验证据很少，使用针对PCT的降钙素部分的抗体通过亲和 层析从脓毒症患者分离到循环中的PCT，并且已经得出结论，即PCT3-116是主要的循环PCT 物质（Weglohner等，P印tides2001 ;22 :2099-103.)。目前可以确定的是，甲状腺的C细胞 首先合成前PCT，前降钙素原主要由N端84个氨基酸（含由25个氨基酸的前导肽）、活性 降钙素（32肽）和Katacalcin(21肽）三部分组成，后两部分被4肽（-Gys-Lys-Lys-Arg-) 隔开。前降钙素原进入内质网，经糖基化和酶切除导肽，转变为PCT，PCT又经不同蛋白酶分 别作用，先切除N端肽形成57肽，57肽进一步降解即生成成熟降钙素和Katacalcin，成熟 降钙素的C末端尚需酰胺化才能最后形成活性降钙素，降钙素为活性32肽。
[0004] 实验证明，PCT浓度升高的主要原因是细菌内毒素引发的全身效应。PCT在检测时 表现出的高度特异性的原因是：1、在正常个体中，PCT经过一系列的体内酶催化作用最后 水解形成CT，故其血清中的PCT浓度很低，仅为10~50pg/ml。2、在系统炎症反应综合症 (SIRS)、败血症、急性/慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎和创伤等患者的血清中的PCT浓 度会显著升高，其浓度可达到正常水平的几倍甚至上万倍。研究表明，在LPS血类败血症相 关因子作用下，靶细胞（PBMC)等应急分泌PCT，这时PCT的分泌速率超过转化速率（由PCT 分解成CT)，或者该转换过程缺少相关的水解酶，从而导致血清中PCT浓度成倍升高。3、在 病毒感染、慢性非特异性炎症等患者的血清中PCT浓度持平或稍有增加。因此，PCT可作为 判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标，它不仅与疾病的严重程度成正相关，而且随着 病情的变化而变化。
[0005] 目前国际上开展的PCT浓度检测方法很多，主要有以下几类：
[0006] (1)凝胶法，此方法费事且不易形成自动化检测；
[0007] (2)酶联免疫吸附法，传统的ELISA法检测操作复杂、反应时间较长、灵敏度低；
[0008] (3)放射免疫测定，此方法反应时间长、检测结果不稳定，重复性差，且存在放射性 污染问题；
[0009] (4)免疫发光法，该方法特异性强、灵敏度高，但需要昂贵的实验仪器；
[0010] (5)胶体金层析法，此方法灵敏度低，只能定性无法实验定量检测；
[0011] 在PCT的临床检测中，目前国际市场上免疫检测产品包括法国梅里埃VIDAS，美国 RB公司，美国RD公司等均有推出，VIDAS采用荧光法检测，需要特定的仪器，才能够实现准 确定量；ELISA产品采用双抗夹心法，先将PCT的特异抗体包被在酶标板上，再加入待检样 本37°C孵育，再加入辣根过氧化物酶（即HRP)标记的单克隆抗体37°C孵育，待检样本中的 抗原会与特异单克隆抗体结合并形成夹心结构，再加入四甲基联苯胺显色，颜色的深浅和 待检抗原的浓度呈正相关，从而实现PCT的检测。此类产品在检测时采用两步法，检测速度 慢导致检测耗时过长，检测的准确度也存在不足之处；并且此类方法通常采用PCT单抗或 多抗，检测敏感性不足，在较低浓度下往往无法建立线性良好的标准曲线，导致其无法检测 较低浓度的PCT待测样品。
【发明内容】
[0012] 在本发明的全文中，下述简写分别代表的术语是：
[0013] PCT-人降钙素原；
[0014] PBS-磷酸盐缓冲溶液；
[0015] CBS-碳酸盐缓冲溶液；
[0016] Tirs-三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液；
[0017] BSA-牛血清白蛋白；
[0018] TMB-四甲基联苯胺；
[0019] HRP-辣根过氧化物酶；
[0020] AP-碱性磷酸酶；
[0021] PNPP-对硝基苯磷酸二钠；
[0022] OD-在给定波长下的吸光度。
[0023] 对于PBS、CBS、Tris、TMB等的组成、浓度、pH等，均可采用免疫生物学上的常见类 型。
[0024] 针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种人降钙素原免疫检测试剂盒，能够快速、 准确检测待测样品中PCT的浓度，检测效率高，在20min内即可完成检测操作；检测灵敏度 高，在0· 01ng/ml~20ng/ml范围内均呈现良好的线性；检测成本低，只需使用酶标仪等即 可完成检测。
[0025] 为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
[0026] -种人降钙素原免疫检测试剂盒，试剂盒内包括PCT单克隆多抗包被的酶标板； 至少两个PCT标准品试剂瓶，每个PCT标准品试剂瓶中装有不同浓度的PCT标准品；酶标试 剂瓶，其中装有酶标记的抗PCT的单克隆多抗。
[0027] 对于本发明而言，上述的单克隆多抗体，可以是针对某一个肽段表位的多个单克 隆抗体混合得到，也可以是相应的单克隆抗体与多克隆抗体混合，同样的，也可以是一个或 多个多克隆抗体的混合物。
[0028] 上述单克隆抗体制备方法为本领域技术人员所熟知，GENBANK中获得人降钙素原 蛋白的基因序列，相应的可以得到其N端（N-proCT)、降钙素（Calcitonin，CT)以及下钙素 (Katacalcin，KAT)抗原的多肽序列：
[0029] N 端（N-proCT):
[0030] Ala-Pro-Phe-Arg-Ser-Ala-Leu-Glu-Ser-Ser-Pro-Ala-Asp-Pro-Ala-Thr-Leu-S er-Glu-Asp-Glu-Ala-Arg-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Leu-Val-Gln-Asp-Tyr-Val-Gln-Met-Ly S-Ala-Ser-Glu-Leu-Glu-Gln-Glu-Gln-Glu-Arg-Glu-Gly-Ser-Ser-Leu-Asp-Ser-Pr〇-Arg -Ser
[0031] 降钙素（Calcitonin，CT):
[0032] Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-L ys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-IIe-Gly-Val-Gly-Ala-Pro
[0033] 下钙素（Katacalcin，KAT):
[0034] Asp-Met-Ser-Ser-Asp-Leu-Glu-Arg-Asp-His-Arg-Pro-His-Val-Ser-Met-Pro-G In-Asn-Ala-Asn
[0035] 本发明所述的不同区域的PCT抗原的制备方法，具体步骤如下：
[0036] (1)取1份PCT全长抗原；
[0037] (2)配置2份酶解液：激素原转化酶（Prohormone Convertase，PC)、羧肽 酶（Carboxypeptidase，CP)、氨肽酶（Aminopeptidase，AP)、肽酰甘氨酸轻单氧化酶 (Pepeitdyl Glycine Amidating Mono-oxygenase， PAM)各 30IU/g，溶解在 2 份 20mM Tris (三羟甲基氨基甲烷），500mM NaCl，pH7. 4或者PBS (磷酸盐）缓冲液，pH7. 4。
[0038] (3)加入酶解液，37°C水浴酶解2h~4h ;
[0039] (4)将分别针对N端（N-proCT)、降钙素（Calcitonin，CT)以及下钙素 (Katacalcin，KAT)抗原的三种单克隆抗体单独偶联到层析柱上，将酶解液依次过滤进行亲 和纯化，从而获得N端（N-proCT)、降钙素（Calcitonin，CT)以及下钙素（Katacalcin，KAT) 三种抗原，具体步骤如下：
[0040] a将上述抗体分别结合到蛋白A或蛋白G微珠上。每份湿的微珠结合2份单克隆 抗体。将抗体和蛋白A或蛋白G微珠混合制成匀浆，在总量为10份的溶液中加入大约1份 微珠，室温孵育Ih,混匀。
[0041] b用10倍体积的0. 2mol/L硼酸钠（pH9. 0)洗涤微珠2次，每次以3000g离心2min 或 10, OOOg 离心 30s。
[0042] c用10倍体积的0. 2mol/L硼酸钠（pH9. 0)重悬微珠，留样。加入足量的二甲基庚 二酸酯（固体）至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol/L。
[0043] d室温孵育30min，并混匀，留样。
[0044] e用0· 2mol/L乙醇胺（ρΗ8· 0)洗涤微珠1次以终止反应。然后重悬于0· 2mol/L 乙醇胺，室温孵育2h，混匀。
[0045] f将抗体包被的微珠转入层析柱中，用PBS缓冲液（pH7. 4)冲洗容器。
[0046] g用20倍柱床体积与制备抗原相同的缓冲液洗柱。
[0047] h将抗原液加到柱上，按每毫升柱体积大约lmL/h的速度使抗原溶液流过层析柱。
[0048] i用20倍柱床体积的结合缓冲液（PBS)洗柱。
[0049] k采用分段洗脱法，连续以0. 5倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集每 一组分份。
[0050] 1检测每管的抗原含量，将浓度高的各管合并。
[0051] 将多肽偶联到BSA、OVA、KLH、乳胶微球等较大的蛋白载体上从而产生显著地免疫 反应。KLH由于在ELISA或Western blotting检测中没有抑制作用不影响检测结果。合成 抗原多肽时，在其N端或C端添加一个半胱氨酸残基有利于多肽与载体蛋白的偶联。
[0052] 在KLH分子表面有大量的活性基团，最常用于偶联的是伯胺基团。小的多肽通常 也带有不同基团可以用于偶联，常用的有伯胺基团，羧基和巯基。多肽与KLH的偶联就是利 用这些基团，再通过交联剂（crosslinker)，将多肽上的巯基/羧基/伯胺与KLH上的伯胺 相连，从而形成共价偶联，制备成完全抗原，用于免疫动物获得抗体。所以偶联的伯胺应该 是来自于赖氨酸侧链和N端，而偶联的羧基则来自于天冬氨酸，谷氨酸和C端，巯基则来自 于半胱氨酸。
[0053] 近年来，亲和乳胶微球已被广泛用作免疫载体。聚合物微球提供了 一个应用于诊 断和生物分离的平台。它们可以被涂覆有识别分子，如抗体，抗原，肽，或核酸探针，并且可 以加载疏水性染料和其他化合物。未改性的聚合物微球也被广泛使用于标准仪器的安装和 校准。微球直径范围从20nm到200μπι，具有良好的尺寸均匀性。普通聚苯乙烯微球蛋白吸 附效果很理想，并且已经被一系列的诊断测试和分析所证实。表面改性的微球可与羧基和 伯胺基团进行共价配对。直径在22nm-99nm之间的微球，可作为优良的免疫原偶联物。
[0054] 所得到的PCT各段抗原多肽通过交联剂（crosslinker)，将多肽上的巯基/羧基 /伯胺与KLH上的伯胺相连，从而形成共价偶联，制备成完全抗原，用于免疫动物获得抗体。 偶联的伯胺是来自于赖氨酸侧链和N端，而偶联的羧基则来自于天冬氨酸，谷氨酸和C端， 巯基则来自于半胱氨酸。
[0055] 本发明中所述的单克隆抗体，优选为兔单克隆抗体，具有如下优势：
[0056] 动物经过初次和加强免疫后，原始的B细胞被诱导分化为不同的细胞，包括分泌 抗体的浆细胞和记忆细胞。T细胞表位的MHCI和MHCII而非典型的MH