一种酶标免疫试剂盒及其在血清检测中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶标免疫试剂盒，包括抗体预包被反应板、酶标抗体和发光底物液，所述酶标抗体以大豆过氧化物酶SBP为标记酶；所述发光底物液包括H2O2、鲁米诺和增强剂；所述增强剂为MORPH（4-马琳吡啶）和SPTZ（3-（10′-吩噻嗪基）丙基-1-磺酸盐）。本发明酶标免疫试剂盒引入SBP作为标记酶，一方面此酶的热稳定性比HRP高，具有底物作用范围广，耐热性能高，酸碱稳定性好，pH适用范围宽等优点。另一方面，当使用增强剂MORPH和SPTZ增强化学发光时，化学发光信号增强近百倍，检测灵敏度能够获得大大提高。
【专利说明】一种酶标免疫试剂盒及其在血清检测中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫试剂盒领域，具体涉及一种酶标免疫试剂盒及其在血清检测中的应用。
【背景技术】
[0002]ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此，也适合于血清流行病学调查。不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。
[0003]在ELISA方法中，过氧化物酶的活性通常是通过过氧化物酶催化过氧化氢(H2O2)氧化底物(如四甲基联苯胺TMB)获得的有色产物，用比色法测定有色产物。后来发现基于在H2O2和增强剂的存在下，辣根过氧化物酶(HRP)能够催化氧化鲁米诺，发生“增强化学发光反应”，各种化学发光方法测定酶活的免疫酶试剂盒应运而生。之所以这些增强化学发光反应免疫酶试剂盒得到广泛应用，是因为此法较比色检测免疫法灵敏度要高，且在没有增强剂存在的条件下，HRP催化产生的化学发光信号较低。目前，在HRP催化发光体系中，使用的最为广泛的增强剂是对碘苯酚(PIP)。但是，反应动力学研究表明，HRP催化的H2O2氧化鲁米诺反应检测到的化学发光强度不稳定。刚开始，在很短时间内，发光强度迅速增强并达到最大值，然后很快降低。这种衰减是由底物氧化反应自由基产物与HRP的连接使得HRP的失活所致。因此，HRP催化致使的鲁米诺氧化反应产生的化学发光信号不稳定。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种酶标免疫试剂盒，采用大豆过氧化物酶(SBP)为标记酶，MORPH和SPTZ为增强剂，解决了现有技术中HRP催化致使鲁米诺氧化反应产生的化学发光信号不稳定的问题。本发明还提供了该酶标免疫试剂盒在血清检测中的应用。
[0005]为解决上述问题，本发明采用以下技术方案:
[0006]一种酶标免疫试剂盒，包括抗体预包被反应板、酶标抗体和发光底物液,所述酶标抗体以大豆过氧化物酶为标记酶；所述发光底物液包括H2O2、鲁米诺和增强剂；所述增强剂为MORPH (4-马琳吡啶)和SPTZ (3- (10'-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐)。
[0007]所述抗体预包被反应板经过如下步骤制备得到:
[0008]步骤一、孔板的修饰
[0009]选用全黑的96孔酶标板，修饰抗体缓冲液选用pH9.6的碳酸盐，将100 μ L浓度为5 μ g/mL Abl抗体加入所述96孔酶标板中包被，4°C过夜孵育；PBST充分洗涤三次，PBS再洗涤三次，轻轻拍干，4°C保存；
[0010]步骤二、封闭非特异性活性位点[0011]用200 μ L2%BSA加入到步骤一制备得到的固定有Abl抗体的96孔酶标板内，室温封闭2h，PBS洗涤三次，轻轻拍干，4°C保存，其中，所述2%BSA为PBS配制；
[0012]其中，步骤一和步骤二涉及的PBS为IOmM pH7.4,PBST为PBS配制的0.l%Tween。
[0013]所述酶标抗体采用改良过碘酸钠法制备得到:
[0014]步骤一、取Img大豆过氧化物酶溶于100 μ L PBS中，加入新配制的12.8mg/HiLNaIO4溶液50 μ L，混匀，置室温15min ；
[0015]步骤二、取出步骤一得到的溶液，后加入9μ L/mL乙二醇PBS溶液50μ L，室温放置30min ；
[0016]步骤三、向步骤二得到的溶液中加入含2mg纯化Ab2抗体，混匀，并装入透析袋，于50mM pH9.6碳酸盐缓冲液4°C透析18h,使大豆过氧化物酶和Ab2抗体结合；
[0017]步骤四、向步骤三得到的溶液中加入5mg/ml NaBH4溶液20 μ L，混匀，置4°C还原2h ；
[0018]步骤五、缓慢加入和步骤四得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，轻摇盐析0.5h，132000g离心15min，去上清，沉淀以少许PBS溶解，装入透析袋，于大量PBS中4°C透析过夜；
[0019]步骤六、次日取出离心，以除去不溶物，上层清夜即得大豆过氧化物酶_Ab2抗体结合物，以PBS加至500yL;
[0020]步骤七、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶，低温保存；
[0021]其中，步骤一至七涉及的PBS为IOmM pH7.4。
[0022]所述发光底物液经过如下步骤制备得到:1.2mM SPTZ、0.6mM MORPH、
0.4mMLuminol 和 0.4mM H2O2 于 50mM pH8.5 的 Tris-HCl 缓冲液。
[0023]上述制备的酶标免疫试剂盒在血清检测中的应用。
[0024]本发明的原理:研究表明，在没有增强剂存在下，H2O2氧化鲁米诺反应就能够有效被SBP催化。SBP的另一个特征是:鲁米诺氧化产物能够产生一个持续时间长的化学发光信号。而且，SBP稳定性要比HRP要高，酶的底物作用范围广，耐热性能高，酸碱稳定性好，pH适用范围宽等优点，这些也是储存酶免疫试剂的重要参数。当加入增强剂SPTZ和MMORPH时，化学发光强度可继续增强近百倍，检测信号得到进一步放大，检测灵敏度大大提高。
[0025]本发明的有益效果:
[0026]1、本发明酶标免疫试剂盒引入SBP作为标记酶，一方面此酶的热稳定性比HRP高，具有底物作用范围广，耐热性能高，酸碱稳定性好，PH适用范围宽等优点。另一方面，当使用增强剂MORPH和SPTZ增强化学发光时，化学发光强度由原有的3.5X IO5提高到1.5X107,化学发光信号可增强近两个数量级，检测灵敏度能够获得大大提高。
[0027]2、使用本发明酶标免疫试剂盒不仅实现高通量，一份血样多指标的快速检测，而且与现有技术相同的操作步骤和检测仪器，直接可以使用，无需专业操作人员再培训及仪器、软件的再开发。因此其产业化研究具有广泛的应用前景和重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是本发明酶标免疫试剂盒的实施过程示意图。
【具体实施方式】[0029]下面结合附图和实施例对本发明做更进一步的解释。
[0030]一种酶标免疫试剂盒，包括抗体预包被反应板、酶标抗体和发光底物液,所述酶标抗体以大豆过氧化物酶为标记酶；所述发光底物液包括H2O2、鲁米诺和增强剂；所述增强剂为MORPH和SPTZ，以下实施例MORPH和SPTZ购自于Sigma Aldrich。
[0031]实施例1
[0032]本发明酶标免疫试剂盒实施过程如图1所示。
[0033]本实施例涉及的PBS 为 IOmM pH7.4，PBST 为 IOmM pH7.4PBS 配制的 0.l%Tween。使用的SBP购自美国Bio-Research Products公司。
[0034]第一步，酶标抗体的制备
[0035]采用改良过碘酸钠法:1、取Img SBP溶于IOOyLPBS中，加入新配制的12.8mg/HiLNaIO4溶液50 μ L，混匀，置室温15min ;2、取出后加入9 μ L/mL乙二醇PBS溶液50 μ L，室温放置30min ;3、加入含2mg纯化HCG人绒毛促性腺激素抗体(β -HCG),混匀，并装入透析袋，于50mM pH9.6碳酸盐缓冲液4°C透析18h，使SBP和Ab2抗体结合；4、加入5mg/ml NaBH4溶液20 μ L，混勻，置4°C还原2h ;5、在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，轻摇盐析0.5h，132000g离心15min，去上清，沉淀以少许PBS溶解，装入透析袋，于大量PBS中4°C透析过夜；6、次日取出离心，以除去不溶物，上层清夜即得SBP-Ab2抗体结合物，以PBS加至500μ L ;7、效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。
[0036]第二步，孔板的修饰
[0037]孔板选用全黑、高结合力的96孔酶标板，修饰抗体缓冲液选用为ρΗ9.6的碳酸盐。将100 μ L浓度为5 μ g/mL a -HCG抗体加入孔板中包被，4°C过夜孵育。PBST充分洗涤三次，PBS再洗涤三次，轻轻拍干，4°C保存。
[0038]第三步，封闭非特异性活性位点
[0039]用200μ L2%BSA(PBS配制)加入上述固定有Abl抗体的孔板内，室温封闭2h。PBS洗涤三次，轻轻拍干，4°C保存。
[0040]第四步，血清的检测
[0041]待测血清的检测:将100 μ L待测血清加入上述封闭好的孔板内，室温孵育lh，PBST洗涤三次，PBS再洗涤三次，轻轻拍干。
[0042]第五步，酶标抗体的捕获
[0043]酶标抗体的捕获:加入100 μ L—定稀释度(2000 X )的上述制备的酶标抗体于上述孔板内，室温孵育lh，PBST洗涤三次，PBS再洗涤三次，轻轻拍干。
[0044]第六步，发光底物液加入，发光信号检测
[0045]首先，优化鲁米诺、H2O2, MORPH、SPTZ的浓度以及发光底物液所用缓冲液的pH值，使得发光强度最大。各孔中同时加入优化后的发光底物液:1.2mM SPTZ,0.6mMM0RPH、0.4mMLuminol和0.4mM H2O2于50mM ρΗ8.5的Tris-HCl缓冲液，利用CCD成像立即采集各孔的化学发光信号。因每一孔对应的是血清检验中的各个指标，因而，同时可以检测出同一血清中各指标含量。
[0046]以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。
【权利要求】
1.一种酶标免疫试剂盒，包括抗体预包被反应板、酶标抗体和发光底物液,其特征在于，所述酶标抗体以大豆过氧化物酶为标记酶；所述发光底物液包括H2O2、鲁米诺和增强剂；所述增强剂为MORPH和SPTZ。
2.根据权利要求1所述的酶标免疫试剂盒，其特征在于，所述抗体预包被反应板经过如下步骤制备得到: 步骤一、孔板的修饰 选用全黑的96孔酶标板，修饰抗体缓冲液选用pH9.6的碳酸盐，将100 μ L浓度为5 μ g/mL Abl抗体加入所述96孔酶标板中包被，4°C过夜孵育；PBST充分洗涤三次，PBS再洗涤三次，轻轻拍干，4°C保存； 步骤二、封闭非特异性活性位点 用200 μ L2%BSA加入到步骤一制备得到的固定有Abl抗体的96孔酶标板内，室温封闭2h，PBS洗涤三次，轻轻拍干，4°C保存，其中，所述2%BSA为PBS配制； 其中，步骤一和步骤二涉及的PBS为IOmM pH7.4，PBST为PBS配制的0.l%Tween。
3.根据权利要求1所述的酶标免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体采用改良过碘酸钠法制备得到: 步骤一、取Img大豆过氧化物酶溶于100 μ L PBS中，加入新配制的12.811^/111]^^104溶液50 μ L，混匀，置室温15min ； 步骤二、取出步骤一得到的溶液，后加入9 μ L/mL乙二醇PBS溶液50 μ L，室温放置30min ； 步骤三、向步骤二得到的溶液中加入含2mg纯化Ab2抗体,混匀，并装入透析袋,于50mMpH9.6碳酸盐缓冲液4°C透析18h，使大豆过氧化物酶和Ab2抗体结合； 步骤四、向步骤三得到的溶液中加入5mg/ml NaBH4溶液20 μ L，混匀，置4°C还原2h ； 步骤五、缓慢加入和步骤四得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，轻摇盐析0.5h，132000g离心15min，去上清，沉淀以少许PBS溶解，装入透析袋，于大量PBS中4°C透析过夜； 步骤六、次日取出离心，以除去不溶物，上层清夜即得大豆过氧化物酶-Ab2抗体结合物，以PBS加至500yL; 步骤七、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶，低温保存； 其中，步骤一至七涉及的PBS为IOmM pH7.4。
4.根据权利要求1所述的酶标免疫试剂盒，其特征在于，所述发光底物液经过如下步骤制备得到SPTZ,0.6mM MORPH,0.4mM Luminol 和 0.4mM H2O2 于 5OmM ρΗ8.5 的Tris-HCl缓冲液。
5.权利要求1-4任一权利要求制备的酶标免疫试剂盒在血清检测中的应用。
【文档编号】G01N33/543GK103901192SQ201410108594
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】薛艳春, 苏娟, 车彦军, 王建江, 毛世琴, 朱伟, 田亦平, 蒋镌, 翟丽芬, 陶岚, 刘松琴, 沈丽, 吴慧萍 申请人:靖江市人民医院, 东南大学