一种检测双酚a的化学发光免疫检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，属于工业化合物类环境激素检测【技术领域】。本发明的试剂盒由包被有双酚A-载体蛋白偶联物的不透明白色酶标板、双酚A标准品、双酚A-过氧化物酶标记抗体工作液、发光底物液、浓缩样品稀释液、浓缩洗涤液组成。所述双酚A-载体蛋白偶联物是将双酚A与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联得到，浓缩洗涤液含有0.05%吐温-20。与传统的酶联免疫吸附分析法比较，本发明的试剂盒具有更高的灵敏度，且检测时间短、费用低，可用于环境水样中双酚A的残留量检测。
【专利说明】一种检测双酚A的化学发光免疫检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测环境水样中的双酚A含量或残留量。属于工业化合物类环境激素检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]双酚A (BPA)是聚碳酸酯、环氧树脂和酚醛树脂的原材料，是世界上使用广泛的工业化合物之一。在食品包装和容器内壁涂装中广泛使用，如罐头食品和饮料的包装、奶瓶、水瓶、牙齿填充物所用的密封胶、眼镜片以及其他数百种日用品的制造过程中。BPA在生产和使用过程中通过大气或污水进入水环境，然后在微生物的作用下逐渐分解，其半衰期大约为2.5~4.0 d。BPA属于内分泌干扰物。近年来研究表明，BPA具有雌激素活性，微量甚至痕量的浓度也可能对动物生理状况、生殖系统以及胎儿发育造成不良影响。在某些污染环境下，BPA能干扰多种生物的内分泌功能，影响野生生物安全，甚至威胁人类生命健康。有资料显示双酚A具有一定的胚胎毒性和致畸性，可明显增加动物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌症的发生。因此BPA已经被欧盟一些国家列入优先污染物的黑名单。随着工业和经济的发展BPA的生产和使用大量增加，全球BPA使用量已超过200万吨，其最终归宿是由各种途径进入水环境，并通过食物链作用在水生生态系统中进行传递，对水生生物产生内分泌干扰作用。因此，水样中双酚A的检测技术研究具有十分重要的意义。
`[0003]双酚A有多种分析测试方法，目前主要有分光光度法和荧光测定法、毛细管电泳法、气相色谱法和气-质联用法、液相色谱法和液-质联用法等，这些方法检测精确度高，检阳性率低等特点，但检测仪器价格昂贵、操作比较繁琐，耗时长，检测成本高。酶联免疫吸附分析法是当前应用最广的检测技术之一，主要优点在于检测速度快，样品前处理简单，操作简单，检测成本低，同时便于用于大批量样品的检测。魏孔吉等建立了快速、灵敏检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法，包被抗原浓度13.8 mg/L、抗体稀释2.4X IO5倍，生物素化二抗和酶标亲和素的最佳稀释倍数分别为2000倍和500倍，方法的线性范围0.2 g/L^lOOO g/L;最低检出限0.05 g/L ;方法用于食品和唾液中双酚A含量的测定，样品处理简单，结果满意。
[0004]化学发光免疫检测技术是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光检测技术的高灵敏性和免疫分析技术的高特异性。本发明通过特有的免疫动物制备具有高亲和力、高特异性的双酚A抗体，并采用酶标记抗体，建立一种可以检测水样中双酚A的化学发光免疫试剂盒。本方法具有操作简便、快捷，灵敏度高、特异性好等特点。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中存在的问题，本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现的。化学发光免疫分析是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中双酚A含量越高，反应体系中发光强度越弱；反之，样品中双酚A含量越少，发光强度越高。[0006]本发明是一种检测双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于含有以下成份:
1、包被有双酚A-载体蛋白偶联物的不透明白色酶标板；所述双酚A-载体蛋白偶联物是将双酚A与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联得到，所述载体蛋白为卵血清白蛋白、牛血清白蛋白；
2、双酹A标准品；
3、双酚A-过氧化物酶标记抗体:该成分为用过氧化物酶标记的双酚A抗体，所述双酚A抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；
4、发光底物液:该发光底物液是以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液，分为A液和B液保存，在使用前按1:1混合使用；其中A液位发光增强剂加鲁米诺货发光增强剂加异鲁米诺，B液为过氧化氢溶液或尿素过氧化氢溶液；
5、2倍浓缩样品稀释液；
6、20倍浓缩洗涤液。
[0007]本发明中，所述的不透明白色酶标板为96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶标板。
[0008]本发明中，所述的双酚A标准品，由一系列不同浓度的双酚A标准品组成，浓度为O ng/mL、0.05 ng/mL、0.15 ng/mL、0.45 ng/mL>1.35 ng/mL、4.05 ng/mL。
[0009]本发明中，所述的双酚A-过氧化物酶标记抗体为用过氧化物酶标记的双酚A抗体，如辣根过氧化物酶(HRP)标记的双酚A抗体。
[0010]本发明中，所述的发光底物液为商品化的任一种以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液。
[0011]本发明中，所述所述2倍浓缩稀释液，其成分为0.01mol/L, pH7.4的磷酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液或Tris-HCl缓冲液，使用前请按1:1稀释(I份浓缩样品稀释液+1份去离子水)。
[0012]本发明中，所述20倍浓缩洗涤液，其包含0.05%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间，使用前请按1:19稀释(I份浓缩稀释液+19份去离子水)。
[0013]本发明的双酚A的化学发光免疫检测试剂盒应用于双酚A的检测时，检测步骤为:
(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品；
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20?25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(3)取包被双酚A抗原的酶标板，加标准品/待测样品50yL/孔到对应的微孔中，标准品和样品每个浓度做两个平行实验；
(4)加入双酚A抗体工作液，50μ L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应45 min ；
(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μ L/孔，充分洗涤4飞次，每次间隔10 S，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
(6)加入发光底物液混合液(Α液与B液在使用前按1:1混合)100 μ L/孔，轻轻振荡混匀，混合好后在化学发光检测仪内检测发光强度(RLU)； (7)检测结果的计算:用所获得的标准溶液和试样溶液发光值与空白溶液的比值进行计算。见下式:
相对发光强度=RLU/RULmax 式中:
RLU=标准(或样品)溶液的发光强度值；
RLUmax=空白(浓度为O的标准溶液)的发光强度值；
将计算的相对发光强度值对应双酚Α(μ g/L)的自然对数作半对数坐标系统曲线图。各待测样品的双酚A浓度根据其RLU值在标准曲线上查出，或通过标准曲线相应的方程计算得出。如样品处理中有稀释，应根据标准曲线所得出的样品浓度要再乘以其稀释倍数。即为样本中双酚A的实际浓度。
[0014]本发明的试剂盒可用于动物尿液、血样、组织及内脏等样品中双酚A的残留量检测。与现有的其它检测双酚A残留量的实验方法比较，本发明的试剂盒有以下优点:
(1)采用化学发光免疫法的本发明试剂盒，比色谱方法(高效液相、液质联用、气质联用)、毛细管电泳方法更为快速简便，所需仪器更为简单，检测成本更为低廉，同时具有高通量的特点；
(2)采用化学发光免疫法的本发明试剂盒，比ELISA方法更为灵敏，可以检测出更低浓度和含量的双酚A残留，同时线性范围更宽；
(3)采用化学发光免疫法的本发明试剂盒，减少了二抗的使用环节，从而缩短了检测时间；不透明白色酶标板增加了化学发光检测仪灵敏度。另外，用双酚A-载体蛋白偶联物而非双酚A抗体来包被不透明白色酶标板，减少了双酚A抗体的不稳定性，保证了试剂盒的长期有效性。
【具体实施方式】
[0015]以下通过具体的实施例对本发明作进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
[0016]实施例1
1、试剂盒各组分的制备
(1)双酚A半抗原的制备:将双酚A酸化，在4°C无光低温环境中与亚硝酸钠作用，生成含重氮基正离子的中间体。重氮化的双酚A作为半抗原，用于后面合成免疫抗原与包被抗原；
(2)双酚A-牛血清白蛋白(BSA)免疫原的制备:将双酚A与牛血清白蛋白(BSA)采用重氮化法进行偶联得到免疫抗原；
(3)双酚A-卵血清白蛋白(OVA)包被抗原的制备:将双酚A与卵血清白蛋白(OVA)采用重氮化法进行偶联得到包被抗原；
(4)双酚A-过氧化物酶标记抗体的制备:对6?8周龄的雌性BALB/c小鼠(体重18?20g)，大剂量免疫方案为，首次免疫用160 μg双酚A-BSA与等量弗氏完全佐剂混匀，皮下注射。3周后，再用80 Pg双酚A-BSA与等量弗氏完全佐剂混匀，皮下注射。此后每隔3周用80 Pg双酚A-BSA与等量弗氏完全佐剂混匀，腹腔注射。最后一次脾内免疫80 Pg双酚A-BSA作为加强免疫。三天后处死小鼠，取其脾脏，与骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。通过小鼠腹腔注射杂交瘤细胞来大量制备小鼠腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和亲和层析法纯化腹水，再经透析得到纯化的双酚A单克隆抗体。双酚A单克隆抗体与辣根过氧化物酶偶联，从而得到双酚A-过氧化物酶标记抗体；
(5)包被有双酚A-OVA偶联物的不透明白色酶标板制备:用缓冲液将双酚A-OVA偶联物稀释后用于包被不透明白色酶标板的检测孔，4°C过夜后用PBST缓冲液洗涤，然后加入180 UL封闭液(5%脱脂奶粉溶液)，37°C温育1.5 h，倾去孔内液体，吸水纸拍干后密封保存；
(6)发光底物液制备:以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液，分为A液和B液保存；其中A液位发光增强剂加鲁米诺货发光增强剂加异鲁米诺，B液为过氧化氢溶液或尿素过氧化氢溶液；
(7)2倍浓缩样品稀释液:其成分为0.01mol/L, pH7.4的磷酸缓冲液；
(8)20倍浓缩洗涤液:其成分为含0.05%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围
7.0-7.5 之间。
[0017]2、检测双酚A的化学发光免疫检测试剂盒的组建
组建的检测双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，包含了以下组成部分:
(1)96孔不透明白色酶标板(8孔X12条)包被有双酚A-OVA偶联物，用铝箔袋真空密封包装；
(2)双酚A标准溶液6瓶，浓度分别为:
O ng/mL、0.05 ng/mL、0.15 ng/mL、0.45 ng/mL、L 35 ng/mL、4.05 ng/mL ；
(3)双酚A-辣根过氧化物酶标记抗体溶液；
(4)发光底物A液(鲁米诺及增强剂)，发光底物B液(尿素过氧化氢)；
(5)2倍浓缩样品稀释液。使用前请按1:1稀释(1份浓缩稀释液+1份去离子水)成为工作样品稀释液，其稀释后的工作样品稀释液为0.05 mol/L, pH 7.4的PBST缓冲液；
(6)20倍浓缩洗涤液。使用前请按1:19稀释(1份浓缩稀释液+19份去离子水)成为工作洗涤液，其稀释后的工作洗涤液为PH值范围7.0-7.5之间，含0.05%吐温-20，0.01mol/L的PBST缓冲液。
·[0018]3、双酚A的化学发光免疫检测试剂盒的试用
(1)样品的前处理
取待检水样，若样品比较混池时，可5000 r/min以上,离心5 min或过滤；
(2)化学发光免疫检测试剂盒操作步骤
将标准和试样所需数量的孔条插入微孔板框架中，记录标准和样品的位置。于适当微孔中分别加入50 μ L/孔双酚A标准溶液和待测样品。加入50 μ L/孔双酚A-辣根过氧化物酶标记抗体到每一个微孔中，充分混合后于室温下避光静置温育45 min。将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤4飞次。完全除去孔中的液体，用吸水纸拍干，加入发光底物液混合液(A液与B液在使用前按1:1混合)100 μ L/孔。混合好后立即在化学发光检测仪内检测发光强度(RLU)；
(3)检测结果的计算分析
用所获得的标准溶液和试样溶液发光值与空白溶液的比值进行计算。见下式:
相对发光强度=RLU/RULmax 式中:
RLU=标准(或样品)溶液的发光强度值；
RLUmax=空白(浓度为O的标准溶液)的发光强度值；
将计算的相对发光强度值对应双酚A ( μ g/L)的自然对数作半对数坐标系统曲线图。各待测样品的双酚A浓度根据其RLU值在标准曲线上查出，或通过标准曲线相应的方程计算得出。如样品经过了预先稀释，应根据标准曲线所得出的样品浓度要再乘以其稀释倍数。
【权利要求】
1.一种检测双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于试剂盒中的以下成份: (1)包被有双酚A-载体蛋白偶联物的不透明白色酶标板；所述双酚A-载体蛋白偶联物是将双酚A与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联得到，所述载体蛋白为卵血清白蛋白、牛血清白蛋白； (2)双酹A标准品； (3)双酚A-过氧化物酶标记抗体:该成分为用过氧化物酶标记的双酚A抗体，所述双酚A抗体为单克隆抗体； (4)发光底物液:该发光底物液是以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液，分为A液和B液保存，在使用前按1:1混合使用；其中A液为发光增强剂加鲁米诺货发光增强剂加异鲁米诺，B液为过氧化氢溶液或尿素过氧化氢溶液； (5)2倍浓缩样品稀释液； (6)20倍浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1的双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，其中，所述不透明白色酶标板为96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶标板。
3.根据权利要求1的双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，其中，所述双酚A标准品的浓度为 O ng/mL、0.05 ng/mL、0.15 ng/mL、0.45 ng/mL> 1.35 ng/mL、4.05 ng/mL。
4.根据权利要求1的双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，其中，所述双酚A-过氧化物酶标记抗体工作液是用抗体稀释液稀释成1:20000比例。
5.根据权利要求1的双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，其中，所述发光底物液为商品化的任一种以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液。
6.根据权利要求1的双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，其中，所述2倍浓缩样品稀释液，其成分为0.01mol/L, pH7.4的磷酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液或Tris-HCl缓冲液，使用前请按1:1稀释(I份浓缩样品稀释液+1份去离子水)。
7.根据权利要求1的双酚A的化学发光免疫检测试剂盒，其中，所述20倍浓缩洗涤液，其包含0.05%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间，使用前请按I:19稀释(I份浓缩稀释液+19份去离子水)
【文档编号】G01N33/74GK103792374SQ201210432991
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月4日 优先权日:2012年11月4日
【发明者】杜道林, 洪霞 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司