Crp非免疫纳米金检测试纸条及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型提供了用于检测CRP的非免疫纳米金试纸条，其包括样品垫、纳米金结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和支撑板，其中纳米金结合垫的表面上涂布或嵌有纳米金颗粒。另外，本实用新型还提供了装有该试纸条的试剂盒等。
【专利说明】CRP非免疫纳米金检测试纸条及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于医疗检测器械领域，具体而言，本实用新型涉及检测CRP的非免疫纳米金试纸条及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]C-反应蛋白(本文简称CRP)是由5个相同的亚单位以非共价键结合而成的血清β球蛋白。该蛋白由肝细胞合成，在人的血清、脑脊液、胸腹水等多种体液中均可测出。正常人CRP的浓度很低(0.068?8.2mg/L)，但在组织损伤、急性感染发生后6?8h开始升高，24?48h达峰值，可达正常值的几百倍甚至上千倍，升高幅度与感染程度成正比，炎症治愈后浓度迅速下降，7?12天可恢复正常水平；CRP在病毒感染时不会升高，其变化不受病人的个体差异、机体状态和治疗药物的影响。所以，CRP的持续增高暗示机体存在慢性炎症或自身免疫疾病，如常规C反应蛋白试验应用于存在细菌或病毒感染、慢性炎症性疾病(如:类风湿关节炎)风险的患者，其需要的检测区间为IO-1OOOmg / L0另外，CRP也是诊断和预测心血管事件发生、发展的有效指标，根据美国心脏学会、美国疾病预防与控制中心定义的风险标准，检测低于1.0mg / L为低风险，检测1.0-3.0mg / L为一般风险，检测高于3.0mg / L为高风险。近年来，主要采用ELISA检测CRP，其灵敏度通常可达到0.15mg /L0
[0003]ELISA检测需要试验室设备，用时长，不容易用于日常即时检测。所以，中国专利201010236071和201120160566分别公开了 CRP胶体金免疫层析检测试纸(条)，通过显色观察来判读，无需试验室设备，方便随时随地使用。这些文献公开的都是基于抗原-抗体反应的免疫学原理进行的，其中在硝酸纤维素膜上设有包被有C反应蛋白抗体的检测线。然而，本发明人研究发现，抗体、抗原等大蛋白质分子受热容易变性，尤其在日常可接触的高温(如:40°C)下，可加速稳定性丧失，其检测灵敏度甚至可以下降两个数量级，而试纸条的使用和储运环境恰恰比较随意而恶劣，因此不利于长时间保存，因此不方便日常检测。
[0004]本实用新型的发明人经过长期艰苦研究，开发出了一种新的检测CRP的非免疫纳米金试纸条，其使用简便、灵敏、出结果快捷、无需复杂仪器及特别技巧，尤其是稳定好，即使在较恶劣环境下长期保存、运输，也基本不影响检测灵敏度，从而便于在日常使用。另外，本实用新型还开发了检测CRP的试剂盒，其可以用于半定量。
【发明内容】
[0005]本实用新型的目的在于提供一种新的纳米金试纸条，该试纸条能够用于检测CRP，而且它不采用抗原-抗体检测的免疫学原理。另外，本实用新型还提供了装有该试纸条的
试剂盒等。
[0006]具体而言，在第一方面，检测CRP的非免疫纳米金试纸条，所述试纸条包括样品垫、纳米金结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和支撑板，其特征在于，以样品垫、纳米金结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维膜和吸水垫这4部件依次为序排列，相邻两部件间边缘接触或重合，而且这4部件全部固定于支撑板上，其中纳米金结合垫的表面上涂布或嵌有纳米金颗粒，硝酸纤维膜表面上带有检测线和质控线不重合。
[0007]理论上，样品垫、纳米金结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维膜和吸水垫这4部件中相邻两部件边缘接触，就能完成纳米金颗粒的转移，但是优选边缘重合。优选在本实用新型第一方面的纳米金试纸条中，重合1_3_，如重合2_。
[0008]本实用新型第一方面的纳米金试纸条还可以包括上盖板。这有助于用户的握持和保存。优选在本实用新型第一方面的纳米金试纸条中，所述4部件的上表面覆盖有上盖板，其中上盖板带有两个开口，包括位于样品垫上方的开口和位于检测线和质控线上方的开口。
[0009]在本文中，固定和覆盖可以采用热层压技术固定和覆盖，这对于本实用新型的寡核苷酸的热稳定性好来说，是特别有益的。但是，由于粘合设备成本较低，所以也优选采用粘合固定和覆盖。
[0010]优选在本实用新型第一方面的纳米金试纸条中，纳米金结合垫与硝酸纤维膜接触或重合在硝酸纤维膜靠近检测线的一侧，而且吸水垫与硝酸纤维膜接触或重合在硝酸纤维膜靠近质控线的一侧。
[0011]检测线和质控线不能重合。优选在本实用新型第一方面的纳米金试纸条中，检测线和质控线间距为0.4-lcm,优选为0.6cm。
[0012]优选在本实用新型第一方面的纳米金试纸条中，样品垫的表面上涂布或嵌有酪蛋白、聚乙烯醇和吐温-20。其中，在表面上涂布或嵌有可以采用浸泡后再干燥来进行的。优选浸泡在含有酪蛋白、聚乙烯醇和吐温-20的溶液中，更优选浸泡在含有1-5% (W / W)酪蛋白、0.1-1% (W / W)聚乙烯醇和 0.05-0.5% (ff / W)吐温-20 的 PBS 溶液(pH7.0-7.6)中，如浸泡在含有3% (ff / W)酪蛋白、0.5% (ff / W)聚乙烯醇和0.1% (ff / W)吐温-20的 20mMPBS 溶液(ρΗ7.2)中。
[0013]优选在本实用新型第一方面的纳米金试纸条中，硝酸纤维膜的检测线上涂布或嵌有第二寡核苷酸，而且硝酸纤维膜的质控线上涂布或嵌有亲和素。有多种市售的亲和素可供选择。优选在本实用新型第一方面的方法中，亲和素是链球菌亲和素。
[0014]更优选在本实用新型第一方面的纳米金试纸条中，纳米金颗粒是连接有第一寡核苷酸和生物素的纳米金颗粒，其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸是不同的。
[0015]本实用新型采用非免疫机理，利用连接寡(聚)核苷酸的纳米金颗粒与CRP的特异结合，来实现试纸条对CRP的检测。寡核苷酸能够为本领域技术人员操作，可以在其末端进行连接，如第一寡核苷酸的5’末端标记生物素。在本文中，如无相反指示，寡核苷酸为单链寡核苷酸，其长度为10-40nt，优选为12-35nt，如16_30nt。
[0016]涂布或嵌有可以通过喷洒均匀相应溶液，然后干燥来进行的。例如，连接有第一寡核苷酸和生物素的纳米金颗粒是稀释成0.05-2mg / ml (优选0.25mg / ml)的溶液，以10-100微升/ cm(优选50微升/ cm)的量喷在结合垫上。又如，第二寡核苷酸稀释成0.l-2mg/ml (优选0.5mg / ml)的溶液，以0.5-5微升/ cm (优选I微升/ cm)的量喷在硝酸纤维膜上。还如，亲和素稀释成0.2-3mg / ml (优选Img / ml)的溶液，以0.5-5微升/cm(优选I微升/ cm)的量喷在硝酸纤维膜上。
[0017]更加优选在本实用新型第一方面的纳米金试纸条中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别选自如下序列的寡核苷酸:
[0018]5， -atgggggggtatgatt-3，；
[0019]5’ -atgggtgggtatgggt-3’ ；
[0020]5， -aagcgggtgggtgtgt-3，；
[0021]5’ -tgggtggggggtgggggttgttgggctgtt-3’ ；
[0022]5’ -tgggtgggcggggtgggttgttgggcggtt-3’ ；
[0023]5， -tgggggagggggcggggccgtagggtgggt-3，；
[0024]5， -cgggtggggggtgggggtcgccgggtcgct-3，；或
[0025]5， -ggggtggggggtgggggtagttgggtcgct-3，。
[0026]在第二方面，本实用新型提供了检测CRP的试剂盒，其装有本实用新型第一方面的纳米金试纸条。在本实用新型的实施例1、2和/或3中，给出了多种本实用新型的纳米金试纸条的实例，它们具有不同灵敏度，可供不同检测要求下使用。
[0027]优选在本实用新型第二方面的试剂盒中，还装有标准图样片。优选其中，标准图样片是印有0、0.1、0.3、0.5、1、2、3和5mg / L CRP溶液上样于本实用新型第一方面的纳米金试纸条后检测线显色的照片。尽管只需要检测线的标准图来比较，但是本发明人发现，许多用户由于没有使用经验，很难通过单一线条的比较来区分出准确的线条，而如果加入了质控线的照片，两条线条的对比，就容易分辨得多。所以更优选其中，标准图样片是印有O、0.1、0.3、0.5、1、2、3和5mg / L CRP溶液上样于本实用新型第二方面的纳米金试纸条后检测线和质控线显色的照片。
[0028]本实用新型带来的有益效果包括:
[0029]1，本实用新型的纳米金试纸条检测快速而且无需特殊设备和培训，全部检测过程约仅需5-10分钟，常人日常操作即可完成。
[0030]2，本实用新型的纳米金试纸条可以适应不同的灵敏度要求，而且灵敏度高，没有出现假阳性结果，检测准确率高。
[0031]3，本实用新型的纳米金试纸条的热稳定性高，对储存条件的要求不高，便于日常条件储存。
[0032]4，本实用新型的纳米金试纸条便于用户持握，本实用新型的试剂盒更便于用户分辨，半定量更准确。
[0033]5，本实用新型的纳米金试纸条制备简便，商品化容易，适合于大、中、小型医院、诊所以及家庭使用，便于推广。
[0034]为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本实用新型进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本实用新型范围的限制。依据本说明书的论述，本实用新型的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
[0035]另外，本实用新型引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本实用新型，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1显示了本实用新型的试纸条(半成品)的结构示意图，其中，I表示样品垫，2表示纳米金结合垫，3表示硝酸纤维膜，4表示检测线，5表示质控线，6表示吸水垫，7表示支撑板。图2显示了本实用新型的试纸条(成品)的结构示意图，其中加了上盖板，其中，4表示检测线(所处的位置)，5表示质控线(所处的位置)，8表示上盖板，81表示样品垫I上方的开口，82表示检测线和质控线上方的开口。
【具体实施方式】
[0037]以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册(如，《分子克隆实验手册》)以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水经Mill1-XQ过滤，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言:1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(简称为EDC)购自Alfa Aesar公司(美国)；金纳米颗粒溶液(粒径为30nm,有羧基标记)购自BB International (美国)；链球菌亲和素购自Sigma-Aldrich(美国);寡核苷酸以及生物素标记的寡核苷酸均委托Sigma-Aldrich公司(USA)合成；试纸条所用基材均可购自上海金标生物技术有限公司。
[0038]实施例1第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒的制备
[0039]取12微升金纳米颗粒溶液置于1.5ml离心管中，1500rpm离心IOmin后,弃上清，加入300微升含0.03M EDC的0.1M咪唑缓冲液(ρΗ7.0)，缓慢摇动离心管20分钟，然后再将12pmol的第一寡核苷酸(其序列为5’-atgggggggtatgatt-3’(编号I)，其5’端标记有生物素)加入，混合后于37°C孵育I小时，期间连续缓慢摇动离心管。5000rpm离心30min后，弃上清，然后洗涤三次(每次加入300微升含IOOmMNaCl的PBS溶液(pH7.2)，然后离心并弃上清)，然后加入240微升含0.5MNaCl的20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)，轻微震荡混合均匀后，即制得第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒，其中第一寡核苷酸浓度约为0.25mg /ml ο
[0040]实施例2本实用新型的试纸条的制备
[0041 ]将第二寡核苷酸(其序列为 5 ’ -cgggtggggggtgggggtcgccgggtcgct-3 ’(编号
7))用20mM PBS(pH7.2)稀释至0.5mg / ml，以I微升/ cm的量横向(以最终制备的试纸条长边方向为纵向，短边方向为横向，下同)喷在硝酸纤维膜上形成检测线；将链球菌亲和素用20mM PBS(pH7.2)稀释至Img / ml，以I微升/ cm的量喷在硝酸纤维膜上距检测线0.6cm处，形成质控线。晾干后，于紫外线交联仪(可购自美国UVP公司，CL-1000)中按默认程序进行紫外线照射(120，OOOmicrojoules / cm2)，然后浸泡在封闭液(配方:SSC(6X)，Denhardt' s 溶液(5X)，SDS (0.5% )，鲑鱼精 DNA(100ug/ml))中 lOmin，于 30°C烘干 8 小时，即获得带有检测线和质控线的硝酸纤维膜3。
[0042]将实施例1制备的第一寡核苷酸标记的纳米金颗粒以50微升/ cm的量横向喷在玻璃纤维膜(结合垫)上，晾干后，即获得纳米金结合垫2。
[0043]将硝酸纤维膜浸泡在样品垫处理液(含3% (ff / W)酪蛋白、0.5% (ff / W)聚乙烯醇和0.1% (W / W)吐温-20的20mMPBS溶液(pH7.2))中I小时，然后于30°C烘干8小时，即获得样品垫I。
[0044]另取棉浆纸作为吸水垫6，剪裁PVC板作为支撑板7。
[0045]如图1所示，以样品垫1、纳米金结合垫2、硝酸纤维膜3和吸水垫6这4个部件依次为序排列，相邻两者边缘间重合2mm，纳米金结合垫2与硝酸纤维膜3重合在硝酸纤维膜靠近检测线4的一侧，吸水垫6与硝酸纤维膜3重合在硝酸纤维膜靠近质控线5的一侧，然后粘贴在支撑板7上，制成了非免疫纳米金检测试纸条(半成品)。
[0046]进一步地，如图2所示，在上述试纸条(半成品)的上表面(即相对于支撑板的另一侧)粘帖上盖板8，其中上盖板8带有两个开口，即位于样品垫I上方的开口 81和位于检测线4和质控线5上方的开口 82，由此制成了非免疫纳米金检测试纸条(成品)。
[0047]实施例3本实用新型的试纸条的质量鉴定
[0048]制备本实用新型的其他试纸条，其参照实施例1和2的方法，所不同的是第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列换成以下表1所列的不同序列，制备的试纸条编号以第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列组合构成，如采用编号8的序列作为第一寡核苷酸和编号3的序列作为第二寡核苷酸制备的试纸条，命名为8-3 ;又如，实施例1和2制备的试纸条命名为 1-7。
[0049]表1寡核苷酸的序列表
[0050]
【权利要求】
1.检测CRP的非免疫纳米金试纸条，所述试纸条包括样品垫、纳米金结合垫、硝酸纤维膜、吸水垫和支撑板，其特征在于，以样品垫、纳米金结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维膜和吸水垫这4部件依次为序排列，相邻两部件间边缘接触或重合，而且这4部件全部固定于支撑板上，其中纳米金结合垫的表面上涂布或嵌有纳米金颗粒，硝酸纤维膜表面上带有检测线和质控线，其中检测线和质控线不重合。
2.权利要求1所述的纳米金试纸条，其特征在于，其中检测线和质控线间距为0.4-lcm。
3.权利要求2所述的纳米金试纸条，其特征在于，其中检测线和质控线间距为0.6cm。
4.权利要求1所述的纳米金试纸条，其特征在于，所述4部件的上表面覆盖有上盖板，其中上盖板带有两个开口，包括位于样品垫上方的开口和位于检测线和质控线上方的开□。
5.权利要求1所述的纳米金试纸条，其特征在于，相邻两部件间边缘重合。
6.权利要求5所述的纳米金试纸条，其特征在于，相邻两部件间边缘重合1-3_。
7.权利要求6所述的纳米金试纸条，其特征在于，相邻两部件间边缘重合2mm。
8.权利要求1所述的纳米金试纸条，其特征在于，纳米金结合垫与硝酸纤维膜接触或重合在硝酸纤维膜靠近检测线的一侧，而且吸水垫与硝酸纤维膜接触或重合在硝酸纤维膜靠近质控线的一 侧。
9.权利要求1所述的纳米金试纸条，其特征在于，样品垫的表面上涂布或嵌有酪蛋白、聚乙烯醇和吐温-20。
10.权利要求1所述的纳米金试纸条，其特征在于，硝酸纤维膜的检测线上涂布或嵌有第二寡核苷酸，而且硝酸纤维膜的质控线上涂布或嵌有亲和素。
11.权利要求10所述的纳米金试纸条，其特征在于，其中亲和素是链球菌亲和素。
12.权利要求10所述的纳米金试纸条,其特征在于,纳米金颗粒是连接有第一寡核苷酸和生物素的纳米金颗粒，其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸是不同的。
13.权利要求12所述的纳米金试纸条，其特征在于，其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别选自如下序列的寡核苷酸:
5， _atgggggggtatgatt_3，；
5， _atgggtgggtatgggt_3，；
5， _aagcgggtgggtgtgt_3，；
-tgggtggggggtgggggttgttgggctgtt-3> ；
-tgggtgggcggggtgggttgttgggcggtt-3> ；
-tgggggagggggcggggccgtagggtgggt-3> ；
5， -cgggtggggggtgggggtcgccgggtcgct-3， -M
-ggggtggggggtgggggtagttgggtcgct-3>o
14.检测CRP的试剂盒，其装有权利要求1-13之任一所述的纳米金试纸条。
15.权利要求14所述的试剂盒，其还装有标准图样片。
【文档编号】G01N33/68GK203786124SQ201320617286
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】游绍进, 张钲, 陈琼, 李为 申请人:苏州友林生物科技有限公司