一种人胰岛素原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种人胰岛素原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括胰岛素原抗试剂1、胰岛素原抗试剂2、磁分离试剂、胰岛素原校准品、化学发光底物、清洗液。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括抗体和生物素的偶联及抗试剂1的配制、酶和抗体的偶联及抗试剂2的配制、磁分离试剂的配制、校准品配制、发光底物配制等步骤。相比市场上现存人胰岛素原试剂盒，本发明的试剂盒具有检测灵敏度高、重复性好、成本低等特点。
【专利说明】一种人胰岛素原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种人胰岛素原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]胰岛素原(Proinsulin，PI)是由β细胞初始分泌的未成熟胰岛素，是一条86个氨基酸组成的长肽链，简称胰岛素原。是胰岛素的前体物质，由胰岛素和C肽组成，具有双重免疫活性，既可与胰岛素抗体结合，又可与C肽抗体结合。胰岛素原由胰岛β细胞合成和分泌，主要在肾脏分解代谢。生理情况下，只有极少量的胰岛素原释放入血，在病理情况下，胰岛β细胞释放胰岛素原增多，血中胰岛素原水平升高。胰岛素原的生物学作用同胰岛素基本一样，只是活性较弱，生物合成的胰岛素原在外周利用葡萄糖的能力只有胰岛素的5% _10%，但它抑制肝脏释放葡萄糖的能力则为利用外周葡萄糖能力的1.5倍。
[0003]I型糖尿病由于胰岛胰岛素合成和分泌极度下降，刚合成的胰岛素原在未转变为胰岛素的情况下即释放入血，造成血浆胰岛素原升高。胰岛β细胞瘤、家族性高胰岛素血症患者血浆胰岛素原水平明显升高；慢性肾功能不全时，胰岛素原的分解代谢降低，可致血浆胰岛素原升高；甲亢时亦可出现血.浆胰岛素原水平升高。因此，胰岛素原的检测对以上情况的诊断具有重要的临床意义。
[0004]正常人空腹时血中胰岛素原的值约为20_240pg/ml，胰岛素原含量过高或过低都会引发其他疾病，为了检测人体内较低浓度的胰岛素原含量，对胰岛素原试剂盒的检测灵敏度提出了更高的有要求。
[0005]目前，胰岛素原的检测方法主要有放射免疫分析法(RIA)(S.J.Rainbow等，Diabetologial979 ；17:229-234)、酶联免疫分析法(EIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)。其中放射免疫分析法必须使用放射性标记物，对操作人员存在危害，同时标记物稳定性较差，且废弃物难以处理，已经逐步被淘汰。酶联免疫分析法(EIA)存在检测范围窄，灵敏度较低，重复性较差等缺点，国外有瑞典Mercodia公司的胰岛素原酶联免疫法试剂盒，其技术工艺优于一般酶联免疫分析法试剂盒，灵敏度和质量较好，但其制备方法由企业作为技术秘密处理，未见于国内外文献和报道，同时价格偏贵，不利于推广使用。
[0006]化学发光免疫分析法是取代放射免疫分析法和酶免疫分析法的主流分析技术，主要原理是所采用的信号物既不是放射物也不是呈现被催化后显示颜色的物质而是化学发光底物，这种发光底物可以在催化剂的催化后从激发态中间体回到稳定基态时发射出光子，通过发光信号测量仪器检测光子数可以实现检测。化学发光免疫分析法的主要优势是灵敏度更高。
[0007]目前市场已出现了已通过注册审批的人胰岛素原化学发光免疫分析法试剂盒，其基本原理为:采用了一株单克隆抗体直接标记了发光物质异鲁米诺衍生物，另一株抗体标记了异硫氰酸突光素(FITC, Fluorescein Isothiocyanate),磁微粒偶联羊抗FITC抗体，形成磁微粒-羊抗FITC抗体-FITC抗体-P1-发光标记抗体复合物，在碱性环境发光标记物发光，由检测器检测到发光信号。此胰岛素原化学发光免疫分析试剂盒虽然采用了化学发光免疫分析法，但其公布的灵敏度等指标相比酶联免疫法没有明显优势，同时检测波动大、重复性差，其设计上主要存在以下缺点:1.采用异鲁米诺直接标记抗体的发光效率低，标记物不稳定，这种直接标记法都属于瞬间发光型(即整个发光过程在不到Is内完成)，不容易保证结果的重复性，同时检测波动大；2.采用FITC与羊抗FITC系统，羊抗FITC作为多抗，取自羊的血清，血清中的复杂成分例如蛋白等会对检测造成干扰；同时不同批次的羊抗FITC对FITC的亲和力和反应速度均不同，会影响每批的检测效果，无法实现生物素亲和素系统的稳定的层级放大作用，对灵敏度没有有益效果，并会出现批内和批间重复性差的缺点。同时，该胰岛素原磁微粒化学发光免疫分析试剂盒的制备方法细节也被厂家作为技术秘密保护，现国内外也未查到胰岛素原化学发光免疫分析试剂盒制备方法的相关资料。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是:弥补上述人胰岛素原试剂盒中存在的不足，提出一种人胰岛素原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法，此试剂盒具有检测灵敏度高、重复性好、成本低等特点。
[0009]根据本发明的试剂盒组份包括:胰岛素原抗试剂1、胰岛素原抗试剂2、磁分离试剂、胰岛素原校准品、化学发光底物、清洗液。
[0010]优选地，所述胰岛素原抗试剂I的主要成分是生物素N羟基丁二酰亚胺酯与胰岛素原单克隆抗体的偶联产物。
[0011]优选地，所述胰岛素原抗试剂2的主要成分是碱性磷酸酶与胰岛素原单克隆抗体的偶联产物。
[0012]优选地，所述磁分离试剂的主要成分是链霉亲和素磁性微粒，大小为200nm_3 μ m,
表面活性基团为链霉亲和素。
`[0013]优选地，所述化学发光底物的主要成分是1，2-二氧环乙烷类衍生物或八?5_5。
[0014]优选地，所述1，2_ 二氧环乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2_ 二氧环乙烷、AMPPD (3- (2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧酰)-苯基-1，2- 二氧环乙烷二钠盐)、CSPD、CDP-star 或 Lumigen PPD。
[0015]本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤:
[0016]I)制备胰岛素原抗试剂1，包括以下步骤:a.胰岛素原单克隆抗体与生物素的偶联；b.配制胰岛素原抗试剂I ;
[0017]2)制备胰岛素原抗试剂2，包括以下步骤:a.胰岛素原单克隆抗体与碱性磷酸酶的偶联；b.配制胰岛素原抗试剂2 ；
[0018]3)配制胰岛素原校准品；
[0019]4)配制磁分离试剂；
[0020]5)配制化学发光底物；
[0021]6)配制清洗液；
[0022]7)将上述成分组装成成品。
[0023]根据本发明的方法:[0024]优选地，所述制备胰岛素原抗试剂I的步骤如下:将N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶解于二甲基亚枫制备成终浓度为5.677mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液，之后用
5.677mg/ml的N-轻基琥拍酰亚胺生物素溶液和胰岛素原单克隆抗体按1: 10 (mg: mg)的比例混合，室温反应4小时得到偶联产物；使用分子筛层析方式对偶联产物进行纯化，获得纯度较高的胰岛素原单克隆抗体-生物素偶联物。将纯化后的胰岛素原单克隆抗体-生物素偶联物用工作缓冲液配制成适当浓度，成为抗试剂1，可用浓度范围为0.8-1.2μ g/ml。
[0025]优选地，所述制备胰岛素原抗试剂2的步骤如下:经4-(N_马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)活化的碱性磷酸酶与经2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-1T)活化的胰岛素原单克隆抗体按1: l(mg: mg)的比例混合，2-8°C环境下反应16-24小时得到偶联产物；使用分子筛层析方式对偶联产物进行纯化，获得纯度较高的胰岛素原单克隆抗体-碱性磷酸酶偶联物。将纯化后的胰岛素原单克隆抗体-碱性磷酸酶偶联物用工作缓冲液配制适当浓度，成为抗试剂2，可用浓度范围为0.8-1.2 μ g/ml。
[0026]优选地，所述抗试剂I和抗试剂2的工作缓冲液的配制步骤如下:向容器内依次加入纯化水约 400g, Tris6.05g，牛 Y 球蛋白 1.85g, IMMgCl20.369ml, 0.1M ZnCl20.369ml,BSAl 1.55g，Proclin3000.185ml，混匀后，用4M的盐酸水溶液或4M氢氧化钠水溶液调节pH值至8.0,最后用纯化水定重至500g。
[0027]优选地，所述磁分离试剂的配制步骤如下:用pH值为7.0的0.1M的磷酸盐缓冲液将链霉亲和素磁性微粒的浓度配制为0.5mg/ml的工作液,即为最终的磁分离试剂。
[0028]优选地，所述化学发光底物的配制步骤如下:1，2_ 二氧环乙烷类衍生物或APS-5，Tris,氯化钠和十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，溶解于纯化水中，最终用4M盐酸溶液或4M氢氧化钠溶液调节PH值到9.7。
[0029]一种使用上述任意一项的试剂盒进行胰岛素原检测的方法，包括如下步骤:
[0030]I)分别吸取40 μ I待测血清或胰岛素原校准品、60 μ I胰岛素原抗试剂I和60 μ I胰岛素原抗试剂2 ；
[0031 ] 2)混合后37 °C水浴16分钟；
[0032]3)加30 μ I分离试剂至各试管中；
[0033]4)混合后37°C水浴10.5分钟；
[0034]5)试管连架放入磁分离器，磁场中沉淀2分钟；
[0035]6)弃上清，再加300 μ I清洗液至各试管；
[0036]7)重复步骤5)-6)两次；
[0037]8)将试管转移到发光检测仪上进行检测。
[0038]本发明与现有技术对比的有益效果是:本发明属于磁微粒酶促化学发光法，以链霉亲和素磁微粒作为固定分离相，与生物素同时构成放大体系，使用碱性磷酸酶催化化学发光底物发光，提高了检测灵敏度和准确性。具体有以下优点:
[0039]I)以纳米或微米级的磁微粒作为固定分离相，大大的提高了固定相的表面积，进而增大了固定相上联有的链霉亲和素的数量，放大了体系，提高了产品的灵敏度。
[0040]2)采用生物素-链霉亲和素放大体系，链霉亲和素与生物素的结合，虽不属于免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定，由于I个链霉亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以形成一种类似晶格的复合体，因此把生物素-链霉亲和素系统与高灵敏度的化学发光法结合起来，可以大大提高化学发光试剂产品的敏感度，实现Pg级别甚至更低水平的检测灵敏度。
[0041]3)采用了性能更加稳定的碱性磷酸酶催化的发光系统，相对于辣根过氧化物酶催化的发光系统，碱性磷酸酶性能更加稳定，重现性更好；相对于瞬间发光的异鲁米诺衍生物，1,2- 二氧环乙烷类衍生物或APS-5发光时间更长，可以稳定30分钟以上，发光信号更强，便于仪器捕捉到光信号，增加了产品的稳定性。
【具体实施方式】
[0042]实施例1人胰岛素原化学发光免疫分析测定试剂盒的制备
[0043]I)胰岛素原抗试剂I的制备
[0044](I)胰岛素原单克隆抗体与生物素的偶联:将N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶解于二甲基亚枫，终浓度为5.677mg/ml，将配制好的N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液与浓度为2mg/ml的胰岛素原单克隆抗体按1: 10(mg: mg)的比例混合,室温下反应4小时,用分子筛层析的方法利用偶联物分子量大的特性，从反应混合物中纯化得到纯度高的最终偶联物。
[0045](2)胰岛素原抗试剂I的制备:向容器内依次加入纯化水约400g，Tris6.05g,牛
Y球蛋白 1.85g, IM MgCl20.369ml,0.1M ZnCl20.369ml, BSAl1.55g, Proclin3000.185ml,混匀后，用4M的盐酸水溶液或4M氢氧化钠水溶液调节pH值至8.0,最后用纯化水定重至500g。用配制好的缓冲液将生物素N羟基丁二酰亚胺酯与胰岛素原单克隆抗体的偶联产物配制成浓度为0.8-1.2 μ g/ml (本实施例采用了 1.0 μ g/ml)的工作液，混合30分钟，用
0.22 μ m的滤膜过滤，得到胰岛素原抗试剂I。
[0046]2)胰岛素原抗试剂2的制备(所有溶液均为固体或液体物质加入纯化水溶液到相应的摩尔数或浓度)
[0047](I)胰岛素原单克隆抗体与碱性磷酸酶的偶联:称取3mg2IT，用含有0.1M的氯化钠和0.005M的EDTA水溶液溶解至13.76mg/ml。将2mg/ml的抗体溶液预先加入在尖底试管里，按体积1/100比例加入2IT溶液进行活化。混匀，在室温下反应30分钟。按被活化的IgG体积1/100的比例加入甘氨酸IM溶液，混匀以终止反应，在室温下至少放置10分钟；称取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/ml。在含有2mg/ml碱性磷酸酶的试管中加入其体积1/20的SMCC溶液，混匀后，室温下反应15分钟。按反应总体积1/100的比例加入甘氨酸IM溶液，混匀以终止反应，在室温下至少放置10分钟；将活化好的碱性磷酸酶和胰岛素原单克隆抗体按质量比1:1混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液，混匀后在2?8°C环境下反应24小时。反应结束后，用分子筛层析的方法纯化得到最终偶联物。
[0048](2)胰岛素原抗试剂2的制备:向容器内依次加入纯化水约400g，Tris6.05g，牛
Y球蛋白 1.85g, IM MgCl20.369ml,0.1M ZnCl20.369ml, BSAl1.55g, Proclin3000.185ml,混匀后，用4M的盐酸水溶液或4M氢氧化钠水溶液调节值至8.0,最后用纯化水定重至500g。用配制好的缓冲液将碱性磷酸酶与胰岛素原单克隆抗体的偶联产物配制成浓度为
0.8-1.2 μ g/ml (本实施例采用了 1.0 μ g/ml)的工作液，混合30分钟，用0.22 μ m的滤膜过滤，得到胰岛素原抗试剂2。
[0049]3)胰岛素原校准品的制备
[0050]用过滤后的牛血清将胰岛素原纯品稀释配制，分以下浓度点:0，25，100，300，1000，5000pg/ml，共 6 瓶。
[0051]4)磁分离试剂的制备
[0052]配制pH值为7.0的0.1M的磷酸盐缓冲液，然后用其将链酶亲和素磁分离试剂浓缩液的浓度配制为0.5mg/ml的工作液,即为最终的磁分离试剂。
[0053]5)化学发光底物的制备
[0054]向容器中依次添加纯化水约900g，AMPPDlg, Tris24g, NaCl 160g, CTAC0.0255g,混匀至试剂溶解，用4M的盐酸水溶液或4M氢氧化钠水溶液调节值至调节溶液溶液PH值到
9.7，补加纯化水定容至1000ml。
[0055]底物中的AMPPD，可替换成等量的其他1，2_ 二氧环乙烷类衍生物或APS-5，其他成份不变。
[0056]6)清洗液的制备
[0057]依次向容器内加入纯化水约500g，Tris7g，氯化钠180g，用4M的盐酸水溶液或4M氢氧化钠水溶液调pH至8.7，再加入吐温2016g，曲拉通X-1000.6g，混匀30分钟，最红纯化水定重至800g。
[0058]实施例2本发明的试剂盒的使用方法:
[0059]I)分别吸取40 μ I待测血清或胰岛素原校准品、60 μ I胰岛素原抗试剂I和60 μ I胰岛素原抗试剂2，加至标记好的相应试管的底部。
[0060]2)用多功能涡旋机轻轻往复震荡试管架。
[0061]3)试管连架置37°C水浴16分钟。
[0062]4)加30 μ I分离试剂至各试管中。
[0063]5)用多功能涡旋机轻轻往复震荡试管架。
[0064]6)试管连架37°C水浴10.5分钟。
[0065]7)试管连架放入磁分离器，磁场中沉淀2分钟。
[0066]8)用一大而缓慢的圆周运动倒转磁分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，用强有力的动作拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
[0067]9)加300 μ I清洗液至各试管。
[0068]10)用多功能涡旋机轻轻往复震荡试管架。
[0069]11)试管连架放入磁分离器，磁场中沉淀2分钟。
[0070]12)用一大而缓慢的圆周运动倒转磁分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，用强有力的动作拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
[0071]13)重复步骤(9)-(12)两次。
[0072]14)将试管转移到发光检测仪上进行检测。化学发光免疫分析仪能读取样本发光值并自动转换成胰岛素原的浓度，结果的单位为:Pg/ml。
[0073]15)根据所述发光值强度与胰岛素原浓度的比例关系计算得到所述待测血清中胰岛素原的浓度。
[0074]实施例3本发明的试剂盒的分析性能
[0075]I)灵敏度:< 5pg/ml。
[0076]2)准确度:分别进行低、中和高三个浓度血清(浓度分别50pg/mL、200pg/mL和1000pg/mL)的回收试验平均为98.6%、99.1%和102.3% (三次平均值)。[0077]3)标准曲线范围:0~5000pg/ml
[0078]4)精密度:批内与批间变异均小于10%。
[0079]5)特异性:与类似物(胰岛素，C肽)的交叉反应率都小于0.01%。
[0080]6)稳定性:各组份分别置37°C，考察8天后，各组份仍稳定。
[0081]实施例4本发明的人胰岛素原化学发光免疫分析测定试剂盒与Mercodia公司的酶联试剂盒比较
[0082]取用临床医院收集来的胰岛素原异常样本50例，正常人样本100例。分别使用本发明的试剂盒和Mercodia公司的试剂盒进行样本检测，统计试验结果并进行相关性分析，相关系数达到0.9725，证明这两种方法高度相关，亦证实了本试剂盒的临床使用价值。
[0083]本发明试剂盒的临床试验对比，试验结果见下表:
[0084]
【权利要求】
1.一种人胰岛素原化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:胰岛素原抗试剂1、胰岛素原抗试剂2、磁分离试剂、胰岛素原校准品、化学发光底物、清洗液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胰岛素原抗试剂I的主要成分是生物素N羟基丁二酰亚胺酯与胰岛素原单克隆抗体的偶联产物。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胰岛素原抗试剂2的主要成分是碱性磷酸酶与胰岛素原单克隆抗体的偶联产物。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂的主要成分是链霉亲和素磁性微粒，大小为200nm-3 μ m,表面活性基团为链霉亲和素。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物的主要成分是1，2_二氧环乙烷类衍生物或APS-5。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述1，2_二氧环乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧环乙烷、AMPro(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基_4_(3_磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷二钠盐)、CSPD、CDP-star 或 Lumi gen PPD。
7.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)制备胰岛素原抗试剂1，包括以下步骤:a.胰岛素原单克隆抗体与生物素的偶联；b.配制胰岛素原抗试剂I ; 2)制备胰岛素原抗试剂2，包括以下步骤:a.胰岛素原单克隆抗体与碱性磷酸酶的偶联；b.配制胰岛素原抗试剂2 ； 3)配制胰岛素原校准品； 4)配制磁分离试剂； 5)配制化学发光底物；` 6)配制清洗液； 7)将上述成分组装成成品。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述制备胰岛素原抗试剂I的步骤如下:将N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶解于二甲基亚枫制备成终浓度为5.677mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液，之后用5.677mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液和胰岛素原单克隆抗体按1: 10 (mg: mg)的比例混合，室温反应4小时得到偶联产物；使用分子筛层析方式对偶联产物进行纯化，获得纯度较高的胰岛素原单克隆抗体-生物素偶联物。将纯化后的胰岛素原单克隆抗体-生物素偶联物用工作缓冲液配制成适当浓度，成为抗试剂I，可用浓度范围为 0.8-1.2 μ g/mlo
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述制备胰岛素原抗试剂2的步骤如下:经4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)活化的碱性磷酸酶与经2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-1T)活化的胰岛素原单克隆抗体按1: l(mg: mg)的比例混合，2-8°C环境下反应16-24小时得到偶联产物；使用分子筛层析方式对偶联产物进行纯化，获得纯度较高的胰岛素原单克隆抗体-碱性磷酸酶偶联物。将纯化后的胰岛素原单克隆抗体-碱性磷酸酶偶联物用工作缓冲液配制适当浓度，成为抗试剂2，可用浓度范围为0.8-1.2 μ g/ml。
10.如权利要求7~9所述的方法，其特征在于，所述抗试剂I和抗试剂2的工作缓冲液的配制步骤如下:向容器内依次加入纯化水约400g，Tris6.05g，牛、球蛋白1.85g，IMMgCl20.369ml, 0.1M ZnCl20.369ml, BSAl1.55g, Proclin3000.185ml，混匀后，用 4M 的盐酸水溶液或4M氢氧化钠水溶液调节pH值至8.0,最后用纯化水定重至500g。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述胰岛素原校准品是用过滤后的牛血清将胰岛素原纯品稀释配制得到的。
12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述磁分离试剂的配制步骤如下:用pH值为7.0的0.1M的磷酸盐缓冲液将链霉亲和素磁性微粒的浓度配制为0.5mg/ml的工作液，即为最终的磁分离试剂工作液。
13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物的配制步骤如下:向容器中依次添加纯化水约900g，l，2-二氧环乙烷类衍生物或APS-51g，Tris24g，NaCl 160g,CTAC0.0255g,混匀至试剂溶解，用4M的盐酸水溶液或4M氢氧化钠水溶液调节值至调节溶液溶液PH值到9.7，补加纯化水定容至1000ml。
14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述清洗液的配制步骤如下:依次向容器内加入纯化水约500g, Tris7g,氯化钠180g,用4M的盐酸水溶液或4M氢氧化钠水溶液调pH至8.7，再加入吐温20`16g，曲拉通X-1000.6g，混匀30分钟，最红纯化水定重至800g。
【文档编号】G01N21/76GK103513037SQ201310343665
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】韩子华, 刘向祎, 路晟 申请人:北京润诺思医疗科技有限公司