一种检测牛奶中三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测牛奶中Ξ聚氯胺的化学发光免疫试剂盒，用于检测牛奶中Ξ 聚氯胺的含量。属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002]Ξ聚氯胺（Melamine),化学式CsHeNe，IUPAC命名为：1，3, 5-Ξ嗦-2, 4, 6-Ξ胺，是 一种Ξ嗦类含氮杂环有机化合物，是一种低毒、无味的纯白色单斜棱晶体，形似蛋白粉，广 泛应用于塑料、染料、化肥的生产和纺织工业，含氮量高达66%，且慢性毒性不容易发现，故 经常被人为地添加到食品和动物饲料中W提高N含量，从而造成蛋白质水平虚高。Ξ聚氯 胺本身低毒，但其在酸性或碱性条件下，生成Ξ聚氯酸，Ξ聚氯胺和其共存物Ξ聚氯酸通过 氨键在肾脏内形成不溶性结晶，动物实验结果表明，Ξ聚氯胺的摄入可能会导致繁殖障碍、 膀脫癌、慢性肾炎、肾结石，甚至是膀脫癌，长期摄入高浓度的Ξ聚氯胺，会导致肾衰竭甚至 死亡，特别是对儿童和青少年危害甚大。
[0003] 联合国负责制定食品安全标准的国际食品法典委员会为牛奶中Ξ聚氯胺含量设 定了新标准，每公斤液态婴儿牛奶中Ξ聚氯胺含量不得超过0. 15毫克。我国禁止人为添加 Ξ聚氯胺到食品中，婴儿配方食品中Ξ聚氯胺的限量值为Img/kg，其他食品中Ξ聚氯胺的 限量值为2. 5mg/kg，高于上述限量的食品一律不得销售。
[0004] 现检测Ξ聚氯胺的方法主要有：高效液相色谱（HPLC)、液相色谱-质谱/质谱法 (LC-MS/MS法)和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法（GC-MS法)，气相色谱-质 谱/质谱法（GC-MS/MS法）]。
[0005] 高效液相色谱（HPLC)是最常用的检测方法，具有高效、快速、灵敏度高、假阳性低 等特点，定量限为2mg/kg。但该方法前处理复杂，所需仪器昂贵，操作繁琐，需要专业技术人 员进行操作，不适合Ξ聚氯胺的快速检测。
[0006] 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS法)，该方法灵敏度高、假阳性率低等特点，样 品不需要衍生化处理，可对尿液、血液、肝脏、毛发和眼球样品进行检测，定量限为0.Olmg/ kg。但存在检测仪器造价昂贵，操作步骤繁琐，对操作人员专业素养要求高等问题，难W满 足现场快速检测的要求。
[0007] 气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS法)，灵敏度很高，假阳性率低，定量限为 0.05mg/kg。该方法的主要缺点是样品需要衍生化运样复杂的前期处理。虽然经过衍生化 处理的样品能在质谱中给出更多的结构信息，但是衍生化会产生多个不同的产物并导致样 品的部分丢失，造成实验结果的偏差。而且检测仪器造价昂贵，操作步骤繁琐，样本前处理 复杂、耗时，需要专业检测技术人员进行操作等缺点，无法满足现场快检要求。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于，针对现有技术不足，提供一种检测牛奶中Ξ聚氯胺的化学发 光免疫试剂盒，具有快速、灵敏度高、特异性好、重复性好、操作简便、检测成本低等优点，从 而满足现场快速检测的要求。
[0009] 本发明的另一个目的在于，提供一种牛奶中Ξ聚氯胺的检测方法，该方法操作简 单，灵敏度高、特异性好。
[0010] 本发明主要利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现。化学发光免疫 分析方法是化学发光法和免疫分析法结合的产物，故其同时具有化学发光法的高灵敏度和 免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中Ξ聚氯胺含量越高，反应体系中发光强 度越弱；反之，样品中Ξ聚氯胺含量越少，发光强度越高。
[0011] 本发明一种检测牛奶中Ξ聚氯胺的化学发光免疫试剂盒，包含W下成份： 包被有抗Ξ聚氯胺抗体的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙締化学发光 板。
[0012] 应用抑7.0-7. 5 0. 2-0.4%NaN3,0. 2-0. 3mol/L棚酸盐缓冲液溶液稀释Ξ聚氯 胺纯品，得到的Ξ聚氯胺系列标准品溶液，浓度范围至少包含了 ： 0.01-0. 81ng/ml的浓度 区间。
[0013] 酶标抗原浓缩液：是由Ξ聚氯胺与牛血清蛋白偶合制成的人工抗原与辣根过氧化 物酶偶联制备得到。
[0014] 酶标抗原稀释液：0. 01-0. 02M憐酸盐缓冲液，pH7. 0-8. 0, 0. 5-1%的牛血清蛋 白。
[0015] 发光底物液。发光底物液分为A、B液。A液为化学发光底物-鲁米诺和发光增强 剂-对甲苯酪溶液，B液为过氧化氨脈溶液。
[0016] 浓缩复溶液。浓缩复溶液具体为2倍浓缩憐酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至 工作浓度后使用，用于样品前处理。
[0017] 浓缩洗涂液。浓缩洗涂溶液具体为含有吐溫-20 (Tween-20)缓冲液的20倍浓缩 憐酸盐缓冲液，使用前用双蒸水稀释至工作浓度后使用，用于实验过程中洗涂化学发光板。 [001引本发明溶液的配制： 本发明试剂盒中设及的Ξ聚氯胺标准品溶液、酶标Ξ聚氯胺抗原溶液、化学发光溶液 及洗涂溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其 配制方法如下：
[0019] 1、Ξ聚氯胺标准溶液：W常规方法将Ξ聚氯胺纯品用抑=7. 0-7. 5 0. 2-0. 4% NaNs, 0. 2-0. 3mol/L棚酸盐缓冲液配置，浓度分别为：0ng/ml, 0.Olng/ml, 0. 03ng/ml, 0. 09ng/ml, 0. 27ng/ml, 0. 81ng/ml的Ξ聚氯胺标准溶液。
[0019] 2、酶标Ξ聚氯胺抗原溶液：用Ξ聚氯胺与偶联蛋白偶联制备的人工抗原与辣根过 氧化物酶偶联制备得到，将所得酶标Ξ聚氯胺抗原用酶标Ξ聚氯胺稀释液稀释成1:4000 的工作浓度。
[0020] 3、酶标抗原稀释液：0. 01-0. 02Μ憐酸盐缓冲液，pH7. 0-8. 0, 0. 5-1%的牛血清蛋 白。
[0021] 4、化学发光溶液：A液为鲁米诺含量为0. 01M、对甲苯酪含量为0. 001MpH8. 8的 Ξ(径甲基）氨基甲烧溶液，B液为每100血溶液含巧樣酸2.Ig，无水胞2册〇4 2. 82g，0. 75% 的过氧化氨脈0. 64mL的水溶液。
[0022] 5、浓缩复溶工作液：胞&口〇4 · 2&0 5. 74邑、胞2册〇4 · 12&0 32. 6g溶于1L的去离子 水中。
[0023] 6、浓缩洗涂溶液：按体积分数0. 05%将吐溫-20添加至抑7. 4,0.Imol/L憐酸盐 缓冲液中。
[0024] 7、包被溶液：1. 59g碳酸钢和2. 53g碳酸氨钢溶于1L水中，调节抑9. 5。
[002引 8、封闭溶液配制：lOgBSA溶于1L洗涂溶液中，再加入重量比为5%。的Nar^。
[0026] 本发明化学发光板的包被： 本发明中包被化学发光板采用将抗Ξ聚氯胺抗体置于设定的包被溶液中，W设定的浓 度，在37 °C恒溫箱中反应包被。
[0027] 本发明采用的是抑9.5的碳酸钢-碳酸氨钢缓冲溶液。本发明中微孔板中所包 被的抗Ξ聚氯胺抗体在碱性环境下可W很好的结合在微孔板塑料表面上，可W经受多次洗 板，采用的抗体包被浓度可W从5mg/m；L-20mg/ml。
[002引包被好的微孔板可W用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选BSA，需加入Nar灿方 止变质。
[0029] 酶标Ξ聚氯胺抗原溶液的制备： 本发明中酶标Ξ聚氯胺抗原溶液浓度是决定本发明中Ξ聚氯胺酶联免疫检测试剂盒 测定范围及灵敏度的重要因素。
[0030] 本发明中设及的酶标Ξ聚氯胺抗原溶液可W用酶标Ξ聚氯胺稀释液稀释成 1:4000的工作浓度。
[0031] 按照上述酶标Ξ聚氯胺抗原溶液浓度制备的试剂盒可W达到很好的线性范围 (标准线范围可W达到0. 01-0. 81ng