专利名称：一种计算机辅助开发临床化学诊断试剂盒的方法
技术领域：
本发明属于医疗诊断领域，涉及采用计算机手段辅助开发临床化学诊断试剂盒的技术。
背景技术：
传统上，临床化学试剂盒的开发过程是通过试探的方法，即用实验手段来确定试剂盒的组成和反应条件。例如，某试剂盒中含有组份A，为了确定A的合适浓度，通常是在一系列不同A浓度下进行实验测定，测定时，先要在一个较宽的浓度范围进行多次实验，根据结果再在一个较窄的范围进一步实验。通常，一个试剂盒中的组成成份有十几甚至数十种，因此，按照传统的方法，需要进行大量的实验才能确定各组份比较适合的浓度范围。而且，试剂盒中各组份之间存在相互作用，例如，组份B在组份A浓度为x时的合适浓度与在组份A浓度为y时的合适浓度往往并不相同，因此，通过实验确定试剂盒中各组份的适宜浓度需要进行数量极多的实验，这在实际工作中是很难做到的。
临床化学试剂盒在开发时，其中某些成份，往往有多种替代物。比如每一种酶都有许多种来源，既有来自动物的，也有来自植物的，还有来自微生物的。即使来自同一种生物体的酶，也经常会有多种同工酶，并且，另外还有许多经过基因工程改造的酶。这些酶性能和价格上存在着差异。传统上，在选择合适来源的酶时，往往是分别用这些酶进行实验，根据实验结果和价格判断是否选用某种酶，如前所述，需要进行大量的实验才能得出是否选用某种酶的结论，另外，由于实验手段本身的缺陷，实验的结果还不一定是最优的结果。其它的组份在有多种替代物可选择时也面临着同样的问题。
因此，在传统临床化学诊断试剂盒的开发过程中，开发所需的实验量大、开发周期长、成本高，而且，有限次实验得到的试剂盒配方在性能和成本上仍然有改进的空间。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种计算机辅助开发临床化学诊断试剂盒的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足临床化学诊断试剂盒的开发的需要。
在本发明中，通过计算机程序处理待开发试剂盒各组成成份的特征参数及试剂盒所需的性能参数，从而获得一到多个优选配方，具体地包括以下步骤在计算机程序中(1).输入描述试剂盒中各组成成份相互作用的关系式；(2).输入试剂盒中各组成成份与反应相关的特征常数；(3).输入试剂盒中各组成成份的价格；(4).输入目标试剂盒应达到的性能参数指标；(5).根据所述关系式依次计算试剂盒各组成成份在不同浓度下时试剂盒应具有的性能；(6).比较计算结果与目标性能参数指标的差距，当两者之差符合要求时，保留试剂配方作为基础配方。
(7).比较多个基础配方的成本，并推荐成本较低的配方作为优选配方。
另外，采用本发明描述的方法，还可以用来优选选择最佳的试剂成份，以及在用另外来源的试剂成份替代原来某种成份时，筛选比较合适的替代物。具体地包括以下步骤在计算机程序中
(1).输入描述试剂盒中各组成成份相互作用的关系式；(2).输入试剂盒中非关键组份与反应相关的特征常数；(3).输入试剂盒中非关键组份的浓度；(4).输入试剂盒中各组份的价格；(5).输入目标试剂盒应达到的性能参数指标；(6).根据所述关系式依次计算试剂盒中关键组份在不同浓度下和不同特征常数时试剂盒应具有的性能；(7).比较计算结果与目标性能参数指标的差距，当两者之差符合要求时，输出关键组份的特征常数和浓度；(8).计算关键组份的成本，输出成本较低的关键组分的特征常数作为选择其来源的依据。
在上述计算过程中，所述性能参数指标包括但不限定于所述试剂盒的准确度、线性范围、精密度，还可以包括试剂盒的灵敏度、最低检测限等指标。
所述计算试剂盒应具有的性能的过程为将待检测物质的浓度在一定范围内波动，计算由于待检测物质浓度变化所致发色物质浓度变化而引起的吸光度值变化，从而计算所述吸光度值变化与所述待检测物质的浓度波动的符合程度。
计算精密度时，则对所选试剂盒的各组成成份引入一系列随机误差，计算各个误差条件下待检物质的表观浓度值，再对一系列表观浓度进行统计学处理获得精密度值。
本发明在考虑到传统上采用实验的手段开发临床化学试剂盒的弊端基础上，提出了一种新的用计算机辅助开发临床化学试剂盒的方法，能够大大减少开发过程中实验的次数，并且能得到性能和成本都比传统方法更优越的试剂盒配方。
图1所示为本发明所公开的方法开发临床化学试剂盒的整体过程。
图2所示为计算试剂盒在某种配方时的准确度、线性范围和灵敏度指标的过程。
图3所示为计算试剂盒在某种配方时的精密度的过程。
具体实施例方式
参见图1，本发明的方法包括如下步骤首先分析试剂的反应原理，建立试剂反应原理的数学模型，并将描述所述数学模型的关系式输入到程序中。
临床化学试剂盒所采用的反应一般为酶反应、络合反应、氧化还原反应、解离反应等几种，对于每一个具体的试剂盒，都可以从公知的技术资料获得其详细的反应原理和反应关系式，因此，在此不多述及。
通常，反应关系式中除了包含反应物的浓度外，还包括反应物的特征参数，如解离常数、氧化还原电位、米氏常数等。需要这些参数才能用反应关系式进行计算。一般情况下，大多数物质的特征参数都可以从技术手册中查到，少数无法查到的也可以采用化学领域惯用的实验方法得到。
待开发试剂盒用于临床检测时，必须符合一定的性能指标要求，例如准确度、精密度、线性范围等技术指标要求，这是开发的目标之一，作为约束条件之一输入到程序中。
另一方面，试剂盒成本也是约束条件，因此还需要将试剂盒中各组份的单价也输入程序中。
取得必要的参数后，便可以用程序计算满足约束条件下试剂盒中各组份的浓度，既产品的配方。然后计算在各组份所有可能浓度组合下时试剂盒的性能参数。
性能参数的计算如图2和图3所示。
在图2中，为了计算一个给定各组份浓度的试剂盒的性能参数，首先根据临床检定工作的要求，设定一系列符合临床实际情况的待检测物质浓度，然后根据所述反应关系式和参数分别计算在所述待检物质浓度下，反应中发色物质的浓度，再根据摩尔消光系数将发色物质浓度转换为吸光度值。
然后由吸光度值反过来推算待检物质的表观浓度。这种推算过程采用临床化学领域熟知的定标和插值方法，在此也不多述及。
根据待检物质的预先假定浓度和计算得到的表观浓度便可以进一步计算得到试剂盒的性能参数包括准确度指标、线性范围指标、以及最低检测限和灵敏度等指标。这些指标的计算是统计学和临床化学的熟知技术，在此也不多述及。
图3所示是精密度指标计算过程。在实际临床检测工作中，同一样本的多次重复检测值会在一定范围内波动，这通常是由于仪器和加样等误差引起的。因此，在本发明中，评价待评试剂盒精密度指标时，先按照在实际操作中由于加样等误差导致的试剂各组份浓度波动的范围，生成一系列随机数，然后将试剂各组份分别和所述随机数叠加，再根据叠加后的值计算反应中发色物质的浓度，求出吸光度值，再推算待测物质的表观浓度，根据表观浓度值取得精密度指标。
将计算得到的试剂盒性能参数指标与优化目标中的性能参数指标比较，如果符合要求则保存此时试剂中各组份的浓度作为基础配方。
如此循环反复，在各种反应物的浓度范围内对可能的浓度组合进行计算，并且保存所有的基础配方。最后，根据各种组份的价格计算各个基础配方的成本，取成本较低的作为优选配方输出。
这样，只要在优选配方的基础上进行少数实验便能够开发出符合要求的试剂盒，有效的降低了临床化学试剂盒开发的成本和周期，并且能够使产品的性能比采用传统方法时更好。
显然，当试剂盒中某种或某些组份具有多种替代物时，用本发明所述方法也可以用来优选采用哪种替代物。在临床化学试剂盒中，某种组份的不同替代物之间的差别常表现在特征常数上，例如，某种络合剂的一系列同系物之间的差别表现为解离常数不同，某种酶的不同来源的同工酶之间的差别表现为米氏常数不同。知道试剂盒中该种组份应该具有的特征常数，便等同于知道该种组份的名称和来源。
在本发明中，只要将所述组份的特征常数在给定的范围内变动，然后如同上述变动浓度计算试剂盒性能参数的方法，计算在该物质不同特征常数和浓度下试剂盒的性能参数，并与优化目标比较，输出成本较低时所述组份的特征常数和浓度，便可以由此选择该组份最适合的同系物或同工酶。
实施例1待开发的试剂盒为丙氨酸氨基转移酶试剂盒。用于测定人血清中丙氨酸氨基转移酶的活力。
试剂盒的测定原理为
在测定中，丙氨酸和α-酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶的催化下生成丙酮酸。再利用乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸转化为乳酸，同时使NADH被氧化成NAD+，NADH在340nm波长下有特征吸收峰，因此，可以通过监测340nm波长处吸光度值的变化速率计算得到丙氨酸氨基转移酶的活力。
首先建立上述酶催化反应的数学模型生物化学领域已有的知识表明第一个反应符合乒乓反应的完全速率方程，第二个反应可以简化为单底物米氏方程。
然后将这两个速率方程输入程序中。
第一个反应的参数，包括平衡常数，米氏常数，抑制常数可以从生物化学手册中查得，第二个反应所用的酶为来自兔肌肉的乳酸脱氢酶，从厂家的技术手册查得对乳酸的米氏常数为6.7mmol/l。
根据IFCC公开的技术资料，以及根据生物学实验惯用的手段，设定丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、乳酸脱氢酶的底物的可选浓度范围为丙氨酸(100～2000mmol/l)；α-酮戊二酸(3～100mmol/l)；NADH(0.1～0.3mmol/l)；乳酸脱氢酶(500～10000U/L)。然后将上述浓度范围作为计算参数。
再将待开发的试剂盒应该具有的性能参数作为约束条件也输入到程序中。根据临床化学领域的一般要求，试剂盒的准确度一般要求相对偏差小于等于10％，精密度要求小于等于6％、线性范围应覆盖临床样本浓度，临床上，丙氨酸试剂盒的线性范围应达到1000U/L，并且在线性范围内的线性相关系数R应大于等于0.9975。
将从试剂厂家产品目录中查得得丙氨酸、α-酮戊二酸、乳酸脱氢酶、NADH的单价也输入程序中。
参数接收完毕后，开始计算在上述反应物的各种浓度组合下试剂盒的性能从丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、乳酸脱氢酶的最低浓度开始，逐次增加其中任何一种成份的浓度，每次递增5％，增加后都按所述速率方程开始计算在上述各种组份浓度下时，在线性范围内不同丙氨酸氨基转移酶活力情况下，反应开始后一段时间内NADH的浓度变化情况，将所述NADH浓度变化情况转换为吸光度值，再由吸光度值按临床化学速率法反应类型的计算公式反过来计算丙氨酸氨基转移酶的表观活性。将计算得到的丙氨酸氨基转移酶的表观活性与预先的假定活性比较，按统计学分析，计算准确度、线性、灵敏度等性能指标，判断在假定的组份浓度下所得试剂盒的性能是否符合要求，如果符合要求则记录此时各组份的浓度，作为基础配方保存。然后按照每次5％的梯度增加其中一种组份的浓度，进行下一个循环，直至计算范围覆盖各组份可能的浓度范围。最后，计算基础配方的成本，比较后得到3个优选配方，其中各主要组份的浓度为优选配方1丙氨酸340mmol/l；LDH3.3KU/l；NADH0.2mmol/l；α-酮戊二酸12mmol/l；优选配方2丙氨酸200mmol/l；LDH8.1KU/l；NADH0.18mmol/l；α-酮戊二酸23mmol/l；优选配方3丙氨酸700mmol/l；LDH2.5KU/l；NADH0.31mmol/l；α-酮戊二酸8mmol/l；然后，在上述3个优选配方的基础上进行实验验证，便获得丙氨酸氨基转移酶试剂盒的最终配方。其配方如下丙氨酸340mmol/l；LDH3.3KU/l；NADH0.2mmol/l；α-酮戊二酸12mmol/l。
实施例2待开发的试剂盒为钙试剂盒，采用邻甲基酚酞络合酮比色法，用于测定人血清中钙离子的浓度。
测定原理为
有上述四个反应和钙的测定直接相关。测定中，Ca2+与邻甲基酚酞络合酮生成有色络合物，引起吸光度值增加，在一定的浓度范围内，吸光度增加的值和Ca2+的浓度正相关，所述浓度范围与上述参与反应的物质浓度有关。
在测定过程中，其中Mg2+作为一种干扰物会干扰Ca2+的测定，因此加入8-羟基喹啉屏蔽其干扰作用。
根据分析化学领域已有知识，可知上述四个反应为解离反应，其形式为[AB]＝K[A][B]。首先将上述四个解离方程输入程序中；从分析化学手册中查得上述四个解离常数，然后将解离常数也输入程序；再将预期钙试剂盒应该具有的性能参数包括准确度(相对偏差小于10％)、精密度(CV小于6％)、线性(0～3.8mmol/l)、分析灵敏度(大于0.3A/mmol钙离子)也输入程序。另外，根据临床化学相关知识得知邻甲基酚酞络合酮的浓度范围为0.01～0.2mmol/l；8-羟基喹啉的浓度范围为2～30mmol/l；血清中干扰物质Mg2+的浓度约为1mmol/l。根据化学试剂手册还可以查得邻甲基酚酞络合酮以及8-羟基喹啉的价格。将这些数据都输入程序中。
接着，开始从邻甲基酚酞络合酮以及8-羟基喹啉的浓度范围下限开始，逐步递增其中每一种组份浓度，每次递增5％，开始计算在该浓度组合条件下，Ca2浓度在0～3.8mmol/l范围内，间隔0.1mmol/l时有色络合物的生成数量，再根据有色络合物的摩尔消光系数计算吸光度值，然后，由吸光度值以及临床化学熟知的定标和插值方法反过来推算钙离子的表观浓度。再将钙离子的给定浓度和表观浓度进行统计学分析，判断是否符合准确度、灵敏度、以及线性等性能指标。
然后，根据实际操作中可能存在±1％的加样误差，生成一系列上下波动为±1％的随机数，对邻甲基酚酞络合酮以及8-羟基喹啉等试剂盒组成成份引入±1％的随机误差，计算给定钙离子浓度在有随机误差下的表观浓度，对计算结果进行统计学处理，取得精密度指标。
计算后得到两个优选配方优选配方l邻甲基酚酞络合酮0．08mmol/l；8-羟基喹啉1．1mmol/l；优选配方2邻甲基酚酞络合酮0．06mmol/l8-羟基喹啉2．4mmol/l；然后通过实验对上述优选配方进行验证，确定最终配方。其配方中主要成分为邻甲基酚酞络合酮0．06mmol/l；8-羟基喹啉2．4mmol/l。
实施例3用其它来源的谷氨酸脱氢酶替换原来尿素氮试剂盒中谷氨酸脱氢酶，可供选用的谷氨酸脱氢酶有8种来源，每种来源的性能和价格都不相同。
尿素氮试剂盒的测定原理为
尿素被脲酶水解为二氧化碳和NH3，其中NH3在第二步反应中被谷氨酸脱氢酶催化与α-酮戊二酸生成谷氨酸，并使NADH氧化引起340nm吸光度值降低，吸光度值降低的速率与NH3的浓度正相关。
在本发明中，从生物化学手册中查得第一步反应可近似为单底物米氏反应，第二步反应近似为双底物米氏反应。然后将上述反应方程式输入程序中。原来试剂盒配方中除谷氨酸脱氢酶外的其它组份的浓度和特征参数分别为脲酶400U/L，脲酶对尿素的米氏常数为10．5mmol/ld一酮戊二酸浓度为2．0mmol/l；NADH为O．05mmol/l然后上述数据也输入程序中。再从待选谷氨酸脱氢酶生产厂家的产品手册中获知待选酶的特征常数及价格。根据经验获知，尿素氮试剂盒中谷氨酸脱氢酶的浓度范围应在50～5000U/L之，间。
原来试剂盒的性能要求为准确度相对偏差小于10％，精密度CV小于6％，在0～35.7mmol/l的尿素氮浓度范围内线性相关系数R大于0.9975。
然后对每一种可选的谷氨酸脱氢酶都依次进行如下计算1.在50～5000U/L范围，每次递增5％设定谷氨酸脱氢酶的加入量；2.计算在选用指定厂家谷氨酸脱氢酶及在上述浓度下试剂盒应具有的性能；3.当性能满足要求时，计算酶的用量和成本。
计算后得到两种优选的酶来源优选酶来源1谷氨酸脱氢酶对铵离子的米氏常数为3.2mmol/l，浓度为130U/L；优选酶来源2谷氨酸脱氢酶对铵离子的米氏常数为18mmol/l，浓度为820U/L；进一步通过实验对上述两种来源的酶测试，最后选择优选酶来源1替代原来试剂和的谷氨酸脱氢酶。
权利要求
1.一种计算机辅助开发临床化学诊断试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤在计算机程序中(1).输入描述试剂盒中各组成成份相互作用的关系式；(2).输入试剂盒中各组成成份与反应相关的特征常数；(3).输入试剂盒中各组成成份的价格；(4).输入目标试剂盒应达到的性能参数指标；(5).根据所述关系式依次计算试剂盒各组成成份在不同浓度下时试剂盒应具有的性能；(6).比较计算结果与目标性能参数指标的差距，当两者之差符合要求时，保留试剂配方作为基础配方；(7).比较多个基础配方的成本，并推荐成本较低的配方作为优选配方。
2.一种计算机辅助开发临床化学诊断试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤在计算机程序中(1).输入描述试剂盒中各组成成份相互作用的关系式；(2).输入试剂盒中非关键组份与反应相关的特征常数；(3).输入试剂盒中非关键组份的浓度；(4).输入试剂盒中各组份的价格；(5).输入目标试剂盒应达到的性能参数指标；(6).根据所述关系式依次计算试剂盒中关键组份在不同浓度下和不同特征常数时试剂盒应具有的性能；(7).比较计算结果与目标性能参数指标的差距，当两者之差符合要求时，输出关键组份的特征常数和浓度；(8).计算关键组份的成本，输出成本较低的关键组分的特征常数作为选择其来源的依据。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述性能参数指标包括但不限定于包括准确度、线性范围、精密度。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述计算试剂盒应具有的性能的过程为将待检测物质的浓度在一定范围内波动，计算由于发色物质浓度变化而引起的吸光度值变化，从而计算所述吸光度值变化与所述待检测物质的浓度波动的符合程度。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述精密度的计算过程为对所选试剂盒的各组成成份引入一系列随机误差，由此对计算得到的待检物质的一系列表观浓度值进行统计学处理获得精密度值。
6.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所说的临床化学诊断试剂盒为丙氨酸氨基转移酶试剂盒。
7.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所说的临床化学诊断试剂盒为钙试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种计算机辅助开发临床化学诊断试剂盒的方法，通过计算机程序处理待开发试剂盒各组成成分的特征参数及试剂盒所需的性能参数，从而获得一到多个优选配方。包括在计算机程序中输入描述试剂盒中各组成成分相互作用的关系式；各组成成分的价格及与反应相关的特征常数；目标试剂盒应达到的性能参数指标。然后计算试剂盒各组成成分在不同浓度下时试剂盒应具有的性能，并推荐符合目标性能参数、成本较低的试剂配方作为优选配方。
文档编号G06F17/00GK1702643SQ200510025720
公开日2005年11月30日 申请日期2005年5月10日 优先权日2005年5月10日
发明者肖禄生, 邬明麒 申请人:上海科华东菱诊断用品有限公司