一种检测胃泌素释放肽前体的化学发光免疫检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析领域，具体地涉及一种检测胃泌素释放肽前体的化学发光免 疫检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺癌是一种恶性程度较高的肿瘤性疾病，其发病率增长速度亦高居各恶性肿瘤 之首。其中小细胞肺癌（smallcelllungcancer,SCLC)占肺癌的15%~20%，是一种恶 性程度高、生长迅速、易早期转移的特殊肺肿瘤。SCLC具有生长分数高、倍增时间短的特点， 大部分患者在就诊时已属晚期，五年生存率低、预后差。因此，对SCLC进行早期诊断和早期 治疗尤为重要。随着化学、分子生物学的发展，肿瘤标志物（tumormarker，TM)已成为诊断 恶性肿瘤的重要手段之一。TM是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞所产生或分泌并 释放到血液、细胞、体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质。TM具有高效、方便、标本易获 取及创伤小等优点，其对肺癌的辅助诊断、组织学分型、临床分期、预后判断和疗效监测具 有重要应用价值。
[0003]胃泌素释放肽前体（ProGRP)是近年来新发现的一种针对SCLC的新的激素类肿瘤 标志物，它不仅可用于SCLC的早期诊断，还有助于判断疗效及早期发现肿瘤复发。proGRP 在人血清中的临界值为50pg/mL，其对SCLC早期诊断的特异性为100 %，检测灵敏度为75 % 左右，其诊断SCLC的特异性可达95%以上，其常规的检测方法为双抗体夹心法（ELISA)、放 射免疫分析测定法（RIA)及化学发光法。ELISA和RIA检测方法检测速度相对较慢，检测的 灵敏度和准确性也较差。
[0004] 化学发光免疫检测技术是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化 学发光检测技术的高灵敏性和免疫分析技术的高特异性。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提出一种检测胃泌素释放肽前体 的化学发光免疫检测试剂盒，利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现的，具 有高灵敏度和免疫分析法的高特异性。
[0006] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明的检测胃泌素释放肽前体的化学发光免 疫检测试剂盒包括如下组分：包被有ProGRP偶联物的不透明白色酶标板；一系列浓度的 proGRP标准品；proGRP的过氧化物酶标记抗体：发光底物液；浓缩样品稀释液；20倍浓缩 洗涤液。
[0007] 优选地，所述的不透明白色酶标板为36孔或96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明 白色酶标板。
[0008] 所述的proGRP偶联物是将proGRP与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联 得到，所述载体蛋白为卵血清白蛋白。
[0009] 所述的proGRP标准品的浓度为 0ng/mL、0. 05ng/mL、0. 15ng/mL、0. 45ng/mL、 L35ng/mL、4. 05ng/mL〇
[0010] 所述proGRP-过氧化物酶标记抗体为用过氧化物酶标记的proGRP抗体，其中，所 述proGRP抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述proGRP-过氧化物酶标记抗体的工作液是 用抗体稀释液稀释成I:20000比例。
[0011] 其中，所述的抗体稀释液为0.OlMpH7. 2的PBS缓冲液，其中包含1%BSA、0. 1% 冷鱼胶（coldfishskingelatin)和 0.05%硫柳萊（Thimerosal)。
[0012] 所述的发光底物液是以鲁米诺或异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液。
[0013] 具体地，所述的发光底物液分为A液和B液保存，在使用前按1:1混合使用，其中 A液为发光增强剂与鲁米诺的混合物，或发光增强剂与异鲁米诺的混合物；B液为过氧化氢 溶液或尿素过氧化氢溶液。
[0014] 优选地，所述的发光增强剂为对碘苯酚或吩噁嗪盐类化合物。
[0015] 上述发光底物液也可以为商品化的任一种以鲁米诺或异鲁米诺为发光剂的化学 发光底物液。
[0016] 优选地，所述的浓缩样品稀释液为2倍浓缩样品稀释液，其成分为磷酸缓冲液、甘 氨酸-HCl缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的任意一种，浓度为0. 01m〇l/L，pH为7. 4,使用前 用去离子水按体积比1 :1稀释。
[0017] 优选地，所述的浓缩洗涤液为20倍浓缩洗涤液，其包含0. 05%吐温-20,0.Olmol/ L的PBST，pH值范围7. 0~7. 5之间，使用前用去离子水按照浓缩稀释液：去离子水的体积 比为1 :19稀释。
[0018] 本发明的proGRP的化学发光免疫检测试剂盒应用于proGRP的检测时，检测步骤 为：
[0019] (1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品；
[0020] ⑵将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20~25°C)平衡30min以上，注意 每种液体试剂使用前均须摇匀；
[0021] (3)取包被proGRP抗原的酶标板，加标准品或待测样品50yL/孔到对应的微孔 中，标准品和样品每个浓度做两个平行实验；
[0022] (4)加入proGRP抗体工作液，50yL/孔，轻轻振荡混勾，用盖板膜盖板后置25°C避 光环境中反应45min;
[0023] (5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250yL/孔，充分洗涤4~5 次，每次间隔l〇s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）；
[0024] (6)加入发光底物液混合液（A液与B液在使用前按1:1混合）100yL/孔，轻轻振 荡混匀，混合好后在化学发光检测仪内检测发光强度（RLU);
[0025](7)检测结果的计算：用所获得的标准溶液和试样溶液发光值与空白溶液的比值 进行计算。见下式：
[0026] 相对发光强度=RLU/RULmax式中：
[0027] RLU=标准（或样品）溶液的发光强度值；
[0028] RLUmax=空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值；
[0029] 将计算的相对发光强度值对应proGRP(yg/L)的自然对数作半对数坐标系统曲 线图。
[0030] 各待测样品的proGRP浓度根据其RLU值在标准曲线上查出，或通过标准曲线相应 的方程计算得出。如样品处理中有稀释，应根据标准曲线所得出的样品浓度要再乘以其稀 释倍数。即为样本中proGRP的实际浓度。
[0031] 本发明的试剂盒可用于人体血液样品中proGRP的残留量检测。
[0032] 化学发光免疫分析是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发 光法的高灵敏度和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中，样品中proGRP含量越高， 反应体系中发光强度越弱；反之，样品中proGRP含量越少，发光强度越高。本发明通过特有 的免疫动物制备具有高亲和力、高特异性的proGRP抗体，并采用酶标记抗体，建立一种可 以检测血清中proGRP的化学发光免疫试剂盒。本方法具有操作简便、快捷，灵敏度高、特异 性好等特点。
[0033] 有益效果：与现有的其它检测proGRP残留量的实验方法比较，本发明的试剂盒有 以下优点：
[0034] (1)采用化学发光免疫法的本发明试剂盒，比色谱方法（高效液相、液质联用、气 质联用）、毛细管电泳方法更为快速简便，所需仪器更为简单，检测成本更为低廉，同时具有 高通量的特点；
[0035] (2)采用化学发光免疫法的本发明试剂盒，比ELISA方法更为灵敏，可以检测出更 低浓度和含量的proGRP残留，同时线性范围更宽；
[0036] (3)采用化学发光免疫法的本发明试剂盒，减少了二抗的使用环节，从而缩短了检 测时间；不透明白色酶标板增加了化学发光检测仪灵敏度。另外，用proGRP-载体蛋白偶联 物而非proGRP抗体来包被不透明白色酶标板，减少了proGRP抗体的不稳定性，保证了试剂 盒的长期有效性。
【附图说明】
[0037] 图1为proGRP标准曲线图。
【具体实施方式】
[0038] 以下通过具体的实施例对本发明作进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明， 而不用来限制本发明的范围。
[0039] 实施例1
[0040] 1、试剂盒各组分的制备
[0041 ] (I)proGRP半抗原的制备：将proGRP酸化，在4 °C无光低温环境中与亚硝酸钠作用 (两者的用量比是为1 :1)，生成含重氮基正离子的中间体。重氮化的proGRP作为半抗原， 用于后面合成免疫抗原与包被抗原；
[0042] (2)pr〇GRP-牛血清白蛋白（BSA)免疫原的制备：将proGRP与牛血清白蛋白（BSA) 采用重氮化法进行偶联得到proGRP-BSA，作为免疫抗原；
[0043] (3)proGRP-卵血清白蛋白（OVA)包被抗原的制备：将proGRP与卵血清白蛋白 (OVA)采用重氮化法进行偶联得到proGRP-卵血清白蛋白（OVA)偶联物，作为包被抗原；
[0044] (4) proGRP-过氧化物酶标记抗体的制备：对6~8周龄的雌性BALB/c小鼠（体重 18~20g)，大剂量免疫方案为，首次免疫用160 y g pr〇GRP-BSA与