一种光致电化学测定谷胱甘肽的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种光致电化学测定谷胱甘肽的方法。
背景技术：
：n-(n-l-γ-谷氨酰-l-半胱氨酰)甘氨酸，即谷胱甘肽，是一种非常重要的硫醇化三肽和内源抗氧化剂，广泛存在于细胞内环境中，是机体内重要的活性物质之一。它在人体生理学中起关键作用。例如，异生生物代谢、对氧化应激的保护、内源性毒性代谢物解毒、酶活性以及硫和氮代谢等。然而，异常水平的谷胱甘肽直接与许多疾病相关，包括癌症、阿尔茨海默氏病和心血管疾病。因此谷胱甘肽含量的检测具有重要的化学与生理学意义。目前，已经开发了许多分析方法来检测谷胱甘肽浓度，包括发光分析法[fruehaufjp,jrmf.reactiveoxygenspecies:abreathoflifeordeath[j].clinicalcancerresearch,2007,13(3):789-794.]，荧光测定法[niuly,guanys,chenyz,etal.bodipy-basedratiometricfluorescentsensorforhighlyselectivedetectionofglutathioneovercysteineandhomocysteine[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2012,134(46):18928-18931.]，比色法[durochers,rezaeea,hammc,etal.disulfide-linked,goldnanoparticlebasedreagentfordetectingsmallmolecularweightthiols[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2009,131(7):2475-2477.]，电化学方法[wangy,luj,tangl,etal.grapheneoxideamplifiedelectrogeneratedchemiluminescenceofquantumdotsanditsselectivesensingforglutathionefromthiol-containingcompounds[j].analyticalchemistry,2009,81(23):9710-9715.]，核磁共振波谱法[opstadks,provenchersw,b.a.bell,etal.detectionofelevatedglutathioneinmeningiomasbyquantitativeinvivo1hmrs[j].magneticresonanceinmedicine,2003,49(4):632-637.mandalpk,tripathim,sugunans.brainoxidativestress:detectionandmappingofanti-oxidantmarker‘glutathione’indifferentbrainregionsofhealthymale/female,mciand1lzheimerpatientsusingnon-invasivemagneticresonancespectroscopy[j].biochemical&biophysicalresearchcommunications,2012,417(1):43-48.]和表面增强拉曼散射法[huanggg,hossainmk,hanxx,etal.anovelreversedreportingagentmethodforsurface-enhancedramanscattering；highlysensitivedetectionofglutathioneinaqueoussolutions[j].theanalyst,2009,134(12):2468-2474.huanggg,hanxx,hossainmk,etal.developmentofaheat-inducedsurface-enhancedramanscatteringsensingmethodforrapiddetectionofglutathioneinaqueoussolutions.[j].analyticalchemistry,2009,81(14):5881-5888.]等。然而，这些方法都具有灵敏度低，选择性差，检测时间长，费力和昂贵，以及临床应用的可靠性差等缺点。因此，开发新型便捷的检测方法是科研工作者的目标之一。鉴于现有技术的不足，本发明基于聚苯胺和纳米二硫化钼纳米复合材料开发了一种新型的光致电化学传感器用于谷胱甘肽的高灵敏度检测，方法具有灵敏度高、选择性好、操作简单的特点。技术实现要素：本发明旨在发明一种方法简单、灵敏度高的测定谷胱甘肽的方法。鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种光致电化学测定谷胱甘肽的方法。实现本发明目的技术方案是：一种光致电化学测定谷胱甘肽的方法。其原理是利用聚苯胺和nanomos2复合材料修饰金电极，研制了一种新型的光致电化学传感器，用于谷胱甘肽的传感检测。首先，利用液相超声剥离法将本体mos2超声剥离成nanomos2，由化学氧化法聚合苯胺单体得到pani。然后将pani与nanomos2用共混法混合成纳米复合材料。将纳米复合材料修饰到金电极表面，制备一种新型的光致电化学传感器，实现对谷胱甘肽的高灵敏度检测。本发明是通过以下措施来实现的：一种光致电化学测定谷胱甘肽的方法，其特征是包括以下步骤：(1)pani与nanomos2的制备；(2)修饰电极的制备；(3)光致电化学检测；优选的，所述的pani与nanomos2的制备包括以下步骤：称取0.0500g本体mos2分散于dmf中，搅拌10min，超声波震荡0.2到12个小时将本体mos2进行剥离，形成浓度为0.1mg/ml～10.0mg/ml的mos2悬浊液，得到nanomos2，放置于4℃冰箱内保存备用。苯胺使用前，通过减压蒸馏除去杂质纯化苯胺本体。量取12.3ml苯胺本体，置于含10ml～100ml1mol/lhcl溶液的三口烧瓶中。在冰浴条件下搅拌0.2h～2h。同时，量取5.7050g的过硫酸铵置于含10ml～100ml三次蒸馏水中的烧杯中，冰浴1h。然后将引发剂过硫酸铵溶液缓慢滴加入到苯胺溶液中，继续搅拌混合液1h，控制反应温度在4℃。反应结束后得到鲜绿色的聚苯胺沉淀，过滤收集。用hcl洗涤沉淀。将洗涤后的沉淀置于干燥箱中干燥。将得到的聚苯胺研磨成粉末，收集起来放置在4℃冰箱内保存备用。优选的，所述的修饰电极的制备包括以下步骤：金电极的预准备：金电极经粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的α-al2o3抛光粉抛光后，用三次蒸馏水冲洗干净，经乙醇，三次蒸馏水分别超声清洗3-5min，高纯氮气吹干备用。nanomos2修饰金电极的制备：取2μl～50μlnanomos2悬浊液滴加到经α-al2o3抛光粉抛光后的金电极表面，在室温条件下自然干燥并过夜，得到nanomos2/ge。pani修饰金电极的制备：用三次蒸馏水将pani配成0.1mg/ml～4mg/ml的分散液，超声半小时，得到悬浊液。然后，取2μl～50μl滴加到金电极表面上，在室温条件下自然干燥并过夜，得到pani/ge。pani/nanomos2纳米复合材料修饰金电极的制备：将nanomos2与pani按一定比例混合，分散在三次蒸馏水中，超声半小时得到悬浊液，然后取2μl～50μl的悬浊液滴加到金电极表面，在室温条件下自然干燥并过夜，得到nanomos2/pani/ge。光致电化学检测包括以下步骤：开启电化学工作站，50s后打开led灯，每10s自动控制开关一次led灯，偏压设置为-0.1-0.5v。采用三电极体系，将ge、nanomos2/ge、pani/ge、pani/nanomos2/cpe等工作电极插入含有谷胱甘肽的pbs溶液中，以光致电化学方法为检测手段，实现对谷胱甘肽的高灵敏度检测。发明的优点与效果当谷胱甘肽的浓度0.1nmol/l到100μmol/l之间时，随着谷胱甘肽浓度的变化，光致电化学信号有明显变化。其光致电化学信号与谷胱甘肽浓度的对数成良好的线性关系：δi/μa＝0.1676log(c/m)+1.9628，其中相关系数r2＝0.9982，δi＝i–i0，i和i0是pani/nanomos2/ge工作电极在含谷胱甘肽和不含谷胱甘肽的光致电化学信号。实验检出限为3.1×10-11mol/l。对该方法的重现性进行了评价研究，通过用10根不同的pani/nanomos2/ges对浓度为2.0×10-8mol/l谷胱甘肽检测，10次测量结果的相对标准偏差(rsd)在3.2％，表明本发明的测定方法有较好的重现性。附图说明图1pani/nanomos2纳米复合材料的制备示意图及其对谷胱甘肽的光致电化学检测。图2不同工作电极的光致电化学信号图。a图为光致电化学信号曲线图；b图为光致电化学信号柱状图。a,ge；b,pani/ge；c,nanomos2/ge；d,pani/nanomos2/ge。图3谷胱甘肽的浓度与光致电化学信号关系图。a图为光致电化学信号曲线图；b图为光致电化学信号与浓度线性关系。从a到h谷胱甘肽浓度依次为0m,0.1nm,1nm,10nm,100nm,1μm,10μm,100μm。具体实施方式下面的实例将进一步说明本发明的操作方法，但不构成对发明的进一步限制。实例1：一种光致电化学测定谷胱甘肽的方法1.实验部分1.1仪器与试剂1.1.1仪器设备将自制的光源系统与电化学工作站chi-830d联用(上海辰华仪器有限公司)作为pec检测系统；采用三电极系统进行测试，参比电极是232型饱和甘汞电极(sce)，辅助电极是213型铂丝电极(上海雷磁仪器厂)。电子天平(fa1004n型，上海精密科学仪器有限公司)；高速离心机(anke-tgl-16c飞翁牌，上海市安亭科学仪器厂)；超声波清洗器(kq-50e型，500w，昆山市超声仪器有限公司)。1.1.2试剂本体mos2(天津巴斯夫化工有限公司)；苯胺(国药集团化学试剂有限公司)；n,n-二甲基甲酰胺(dmf，天津富宇精细化工有限公司)；浓盐酸(天津迪博化工股份有限公司)；过硫酸铵(天津广成化学试剂有限公司)；氨水(天津市大茂化工试剂厂)；谷胱甘肽(国药集团化学试剂有限公司)；十二水合磷酸氢二钠(天津迪博化工股份有限公司)；二水合磷酸二氢钠(天津市鼎盛鑫化工有限公司)；实验室所用试剂均为分析纯，实验用水为三次蒸馏水。0.1mol/l磷酸盐缓冲溶液(pbs)由0.2mol/l十二水合磷酸氢二钠和0.2mol/l二水合磷酸二氢钠按比例配制，其中含有0.1mol/l氯化钾。将谷胱甘肽溶解于0.1mol/l的pbs溶液中配制成谷胱甘肽的标准液。1.2pani与nanomos2的制备称取0.0500g本体mos2分散于20mldmf中，搅拌10min，超声波震荡4个小时将本体mos2进行剥离，形成浓度为2.5mg/ml的mos2悬浊液。得到nanomos2。放置于4℃冰箱内保存备用。苯胺使用前，首先通过减压蒸馏除去被氧化的杂质纯化苯胺本体。量取12.2826ml苯胺本体，置于50ml1mol/l的hcl溶液的三口烧瓶中。在冰浴条件下搅拌1h。同时，量取5.705g的过硫酸铵(aps)置于50ml三次蒸馏水中，冰浴1h。然后将引发剂过硫酸铵溶液缓慢滴加入到苯胺溶液中，继续搅拌混合液1h，控制反应温度在4℃。反应结束后得到鲜绿色的聚苯胺沉淀，过滤收集。用1mol/l的hcl洗涤沉淀。将洗涤后的沉淀置于干燥箱中干燥。将得到的聚苯胺研磨成粉末，收集起来放置在4℃冰箱内保存备用。1.3修饰电极的制备金电极的预准备：金电极(ge)经粒径为1.0μm、0.3μm、0.05μm的α-al2o3抛光粉抛光后，用三次蒸馏水冲洗干净，经乙醇，三次蒸馏水分别超声清洗3-5min，高纯氮气吹干备用。nanomos2修饰的金电极(nanomos2/ge)的制备：取10μl悬浊液滴加到经α-al2o3抛光粉抛光后的金电极表面，在室温条件下自然干燥并过夜，得到nanomos2/ge。pani修饰的金电极(pani/ge)的制备：用三次蒸馏水将pani配成0.4mg/ml的分散液，超声半小时，得到悬浊液。然后，取10μl滴加到金电极表面上，在室温条件下自然干燥并过夜，得到pani/ge。pani/nanomos2纳米复合材料修饰的金电极(pani/nanomos2/ge)的制备：将nanomos2与pani按一定比例混合，分散在三次蒸馏水中，超声半小时得到悬浊液，然后取10μl的悬浊液滴加到金电极表面，在室温条件下自然干燥并过夜，得到nanomos2/pani/ge。1.4光致电化学检测开启电化学工作站，50s后打开led灯，每10s自动控制开关一次led灯，偏压设置为-0.1-0.5v(vs-sce)。采用三电极体系，将ge、nanomos2/ge、pani/ge、pani/nanomos2/cpe等工作电极插入含有谷胱甘肽的pbs溶液中，以光致电化学方法为检测手段，实现对谷胱甘肽的高灵敏度检测。实例2：不同工作电极的光致电化学信号比较将ge、nanomos2/ge、pani/ge、pani/nanomos2/cpe等工作电极插入含有1μm的谷胱甘肽的pbs溶液中，进行光致电化学测定，发现ge、nanomos2/ge、pani/ge、pani/nanomos2/cpe对应信号分别为46na、412na、198na、716na(图2)，说明pani/nanomos2/cpe测定谷胱甘肽的光致电化学具有高的信号响应。实例3：样品测定将含谷胱甘肽的样品溶液进行光致电化学测定，根据光致电化学信号和上述所得标准曲线可以获取谷胱甘肽的含量。根据发明的方法对血液中谷胱甘肽含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，测定结果如表1所示，样品测定回收率为99.5-102.7％，本发明的方法在谷胱甘肽检测中具有精密度高的特点。表1.样品分析测定结果编号含量a,b加入量总量回收率112.2910.0022.45101.6％213.5010.0023.77102.7％314.0110.0023.9699.5％a7次测量结果b单位：nm。当前第1页12