一种沙丁胺醇半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种沙丁胺醇半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒，用于检测 动物组织和尿液中的沙丁胺醇残留量，属于免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 沙丁胺醇（SAL)为选择性β2受体激动剂，临床医学上主要用于治疗喘息型支气 管炎、支气管哮喘、肺气肿所致的支气管痉挛。同时，沙丁胺醇还有促进动物骨骼肌生长，减 少脂肪蓄积、提高饲料转化率等作用，常被不法商家用作饲料添加剂。人食用了含沙丁胺醇 残留的动物性食品，会出现肌肉震颤、心悸、过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、呼吸困难等症状。 现在欧美各国均禁止其在畜牧生产上的应用，美国规定只能把它用于科研，我国农业部235 公告也明确规定沙丁胺醇及其盐、酯为禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出。
[0003]目前检测沙丁胺醇的方法主要有高效液相色谱法（HPLC)、气相色谱-质谱法 (GC-MS)、液相色谱-质谱法（LC-MS)等，但这些方法都不同程度地存在着样品前处理繁琐， 对仪器设备以及操作过程的要求较高等缺点，不适于生产、基层单位及现场检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种沙丁胺醇半抗原与抗原及其专用化学发光免疫试剂盒。
[0005] 本发明提供的半抗原，为式（I)所示的化合物；
[0006]
[0007] 式（I)所示的化合物具体可为按如下方法制备得到的化合物：（1)取478mg沙 丁胺醇溶于15mL乙醇，加入434mg碳酸钾，200mg环氧氯丙烷，混合均匀，室温搅拌反应2h; ⑵制备薄层色谱纯化混合物，展开剂为二氯甲烷：甲醇，体积比5:1，Rf值0.6处为产物 点；（3)将产物点处硅胶刮下，用甲醇提取2次（每次可采用25mL甲醇），过滤并收集滤液， 将滤液进行真空干燥，得到的干物质即为式（I)所示的化合物。
[0008]本发明还保护式（I)所示的化合物与载体蛋白的偶联物（该偶联物为免疫原或 包被原）。所述载体蛋白具体可为BSA或0VA。
[0009] 本发明提供一种用于检测沙丁胺醇的化学发光免疫试剂盒，包括包被有所述偶联 物的化学发光微孔板（偶联物作为包被原），沙丁胺醇标准品工作液，浓缩酶结合物，浓缩 样品稀释液，浓缩洗涤液和化学发光液。
[0010] 所述试剂盒还可包括以所述偶联物为免疫原得到的抗体。所述抗体具体可为兔源 多克隆抗体。 toon] 所述"包被有所述偶联物的化学发光微孔板"的制备方法具体如下：（1)取所述 偶联物，用包被缓冲液稀释（包被缓冲液具体可为pH9. 6、0. 03M的碳酸盐缓冲液），得到包 被原稀释液（蛋白浓度具体可为20ng/mL);(2)将包被原稀释液加入化学发光微孔板（具 体可100μL/孔），孵育（具体可40°C孵育16小时），洗涤，拍干；（3)完成步骤⑵后，进 行封闭（每孔可加入100μL封闭液，室温封闭2h;封闭液的具体配方：将10gBSA、0.lmL proclin300和1000mLpH7. 4、0. 01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液），倾去孔内的液 体，干燥。
[0012] 本发明提供的试剂盒操作简便、特异性好、灵敏度高，各项性能优良，非常适于推 广应用。
【附图说明】
[0013] 图1为标准曲线图。
【具体实施方式】
[0014] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
[0015] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0016] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0017] 以下实施例中试剂盒的检测原理如下：
[0018] 实施例1中的搅拌都是采用磁力搅拌器进行的。二甲基甲酰胺（DMF) :sigma，型 号：D4551。沙丁胺醇：sigma，型号：S0100000。其他试剂均购自国药集团，为分析纯。
[0019] 沙丁胺醇的结构式如下：
[0020]
[0021] 实施例1、免疫原和包被原的制备
[0022] -、半抗原的制备
[0023] 1、取478mg沙丁胺醇，溶于15mL乙醇中，分别加入434mg碳酸钾和200mg环氧氯 丙烷，混合均匀，室温下搅拌，反应2h。
[0024] 2、制备薄层色谱，展开剂为二氯甲烷：甲醇，体积比5:1，取步骤1得到的溶液，低 于色谱板上。Rf值〇. 6处为产物点，将此处硅胶刮下，用甲醇提取2次（每次采用25mL甲 醇），合并有机相，过滤并收集滤液，将滤液进行真空干燥，得到的干物质即为半抗原。
[0025] 半抗原的结构式见式（I)。
[0026]
[0027] 二、免疫原的制备
[0028] 1、取6.6mg步骤一制备的半抗原，溶于2mLDMF。
[0029] 2、取50mgBSA，溶于5mL0· 1M碳酸钠缓冲液。
[0030] 3、将步骤1得到的溶液逐滴加至步骤2得到的溶液中，室温搅拌反应24小时，然 后装入透析袋，在4°C条件下，在PBS缓冲液（pH7. 4、0. 01M)中进行透析（3天，每天换液2 次），得到的溶液即为免疫原溶液，简称SAL-BSA。
[0031] 免疫原的结构式见式（II)。
[0032]
[0033] 三、包被原的制备
[0034] 用0VA代替BSA，其它同步骤二，得到包被原溶液，简称SAL-0VA。
[0035] 实施例2、多克隆抗体的制备
[0036] 取实施例1制备的SAL-BSA溶液，用ρΗ7· 4、0· 01M的PBS缓冲液稀释，得到免疫原 稀释液，用于多克隆抗体的制备。采用雌性新西兰大白兔作为免疫动物。
[0037]免疫过程如下（免疫剂量以蛋白量计）：
[0038] 首次免疫：将免疫原稀释液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮 下多点注射，免疫剂量为lmg/kg·b.w.;
[0039] 加强免疫：首次免疫后每隔2周进行一次加强免疫，将免疫原稀释液与等体积的 弗氏不完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，单次免疫剂量为lmg/kg·b.w.;
[0040] 末次免疫：首次免疫10周后进行末次免疫，直接颈背部皮下多点注射免疫原稀释 液，免疫剂量为lmg/kg·b.w.。
[0041] 末次免疫1周后,将血清效价为3.OX104以上的兔子处死，分离血清，用饱和硫酸 铵法纯化，分装冻存，即为免疫原对应的多克隆抗体（简称多克隆抗体甲）。
[0042] 实施例3、化学发光免疫检测试剂盒的组装
[0043] 化学发光免疫检测试剂盒包括如下组件：
[0044]1、包被了包被原的化学发光微孔板
[0045] 取实施例1制备的包被原溶液，用包被缓冲液稀释（包被缓冲液即pH9.6、0. 03M 的碳酸盐缓冲液），得到蛋白浓度为2ng/mL的包被原稀释液。将10g牛血清白蛋白、0.lmL proclin300和1000mLpH7.4、0. 01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液。
[0046] (1)将包被原稀释液加入化学发光微孔板（100μL/孔），37°C孵育16小时。
[0047] (2)完成步骤⑴后，倾去孔内的液体，洗涤，拍干。
[0048] (3)完成步骤⑵后，每孔加入200μL封闭液，37°C温育2h。
[0049] (4)完成步骤（3)后，倾去孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0050] 2、多克隆抗体工作液
[0051] 取10mg牛血清白蛋白，用ρΗ7· 4、0· 02M的PBS缓冲液溶解并定容至1000mL，得到 抗体稀释液。
[0052] 将实施例2制备的多克隆抗体甲用抗体稀释液稀释至150000倍体积，得到一抗工 作液甲。
[0053] 3、二抗工作液
[0054] 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自JacksonImmunoResearchLaboratories Inc.产品目录号为115-035-003。
[0055] 将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗用步骤2中的抗体稀释液稀释至1000倍体 积，得到二抗工作液。
[0056] 4、标准品溶液
[0057] 将沙丁胺醇溶于pH7. 4、0. 05M的磷酸盐缓冲液，分别得到浓度为0. 02ng/mL、 0· 06ng/mL、0. 18ng/mL、0. 54ng/mL和 1. 62ng/mL的标准品溶液。将ρΗ7· 4、0· 05M的磷酸盐 缓冲液作为标准品溶液的阴性对照溶液，称为〇溶液。
[0058] 5、发光底物液
[0059] 发光液由Α液和Β液组成，Α液和Β液各一瓶，4mL/瓶。
[0060]A液的制备方法：取0. 2g鲁米诺单钠盐、0.lg对碘苯酚、0. 16g氯化钠和0. 18g EDTA-Na2，用pH8. 4、0. 1M的Tris-HCl缓冲液溶解并定容至 1000mL。
[0061]B液：含 0· 3mMH202、5mMEDTA-Na2 的ρΗ8· 4、0· 1M的Tris-HCl缓冲液。
[0062] 6、20X浓缩洗涤液
[0063] 将1000mLρΗ7· 4、0· 2M的磷酸盐缓冲液与lmLproclin300混合，得到20X浓缩 洗涤