使用辛德毕斯病毒载体和肿瘤相关抗原诱导抗肿瘤免疫的方法
【专利说明】使用辛德毕斯病毒载体和肿瘤相关抗原诱导抗肿瘤免疫的 方法
[0001 ]因为本发明受到美国国家癌症研究所、国立卫生研究院、及卫生和公共事业部的 美国公共健康基金CA100687的资助，美国政府享有本发明的一定权利。
【背景技术】
[0002] 溶瘤病毒(Oncolytic VirUSeS，0V)是肿瘤细胞中特异性靶向和复制的病毒[1]。 由于它们的选择性和溶瘤性，OV作为常规癌症治疗的备选或补充已引起了极大的兴趣[2]。 然而，OV疗法的主要限制是在肿瘤部位不适当的复制和增殖[3,4]。此外，出于安全性原因， 许多OV被设计成复制缺陷型以防止其扩散至健康组织，这进一步限制了它们的溶瘤潜能
[5]。
[0003] 对此问题的一种可行的解决方案是补充具有旁观者效应(bystander effect)的 直接病毒溶瘤作用，其中不直接被OV感染的肿瘤细胞也将被摧毁。这例如可通过将治疗性 或细胞毒性基因插入OV基因组而递送至肿瘤部位来实现[6,7]。赋有天然免疫原性，某些OV 能够有效刺激免疫系统，提高使用OV诱导免疫学抗癌旁观者效应的可能性[8]。这种既得的 观点进一步推动了可由0V(0V/TAA)递送至肿瘤部位[12]的各种临床相关的肿瘤相关抗原 (TAA)的鉴定[9,10]和近期的优化[11]。在其自然状态下，TAA通常免疫原性低下[13]。然 而，通过将抗病毒免疫应答重定向到TAA，免疫原性0V/TAA能够潜在地打破这种免疫耐受 性。因此，OV研究的主要目标应当为开发安全有效的0V/TAA试剂。辛德毕斯病毒（Sindbis virus，SV)为含正单链RNA基因组的甲病毒属[14]，代表选定数量的已展示出既作为0V[15， 16]也作为病毒疫苗[17]的特殊潜能的病毒之一。之前已示出复制缺陷型SV载体靶向并抑 制小鼠中异种移植、同系和自发的肿瘤的生长[16，18]。
[0004] 近来，还已经发现SV诱导荷瘤小鼠中自然杀伤(natural killer，NK)细胞和巨噬 细胞的活化[19]。另外，表达免疫调苄基因如白细胞介素12(IL-12)的SV载体具有提高的抗 肿瘤[16]和免疫刺激[19]作用。然而，这些方法通常还未导致完全的肿瘤缓解（tumor remission) [19]。此外，某些肿瘤细胞可能不被SV有效祀向[20]，强调了对于开发增强SV抗 癌疗法的新途径的需求。
[0005] 之前，假设SV载体的使其成为有效的溶瘤剂和基因递送系统的特质（如通过血流 传播和递送高水平异源蛋白[21]的能力)还能够用于有效的TAA递送。此外，SV生命周期的 特征在于缺少DNA相，使载体更加安全，还涉及高水平双链RNA(dsRNA)(强烈的免疫学'危险 信号'）[22]、以及随后的I型干扰素通路[23]的活化。安全性、免疫原性、有效传播和高TAA 表达的组合使SV/TAA成为引人注目的0V/TAA的候选者。因此，本领域所需要的是使用SV/ TAA治疗患有肿瘤的哺乳动物的方法，从而利用所有上文提到的益处。
【发明内容】
[0006] 本文公开的BALB/c CT26结肠癌肿瘤模型用于探究SV作为0V/TAA试剂的用途。发 现并不像其它试验的肿瘤模型，CT26细胞在体内并不被SV靶向。然而，携带β半乳糖苷酶的 SV载体(SV/LacZ)在荷有表达LacZ的CT26肿瘤的小鼠中具有显著的治疗效力。使用活体成 像系统（in vivo imaging system, IVIS)用于焚光素酶活性的体内灵敏检测[24]，纵膈淋 巴结(mediastinal lymph nodes，MLN)被识别为腹膜内（intraperitoneal，i ·ρ·)注射携带 萤火虫荧光素酶基因的SV载体（SV/Fluc)之后早期瞬时异源蛋白表达的部位。TAA递送至 MLN中标志着强烈免疫应答的起点，而该强免疫应答以显示对LacZ阳性和阴性肿瘤细胞的 强细胞毒性的效应和记忆CD8+T细胞的产生为顶峰。后一种现象被称为表位扩散(epitope spreading)，现已提议为患者中有效癌症免疫疗法的重要组分[25]。
[0007] -方面，本发明提供一种用于治疗患有肿瘤的哺乳动物的方法，所述方法包括以 下步骤:鉴定由该肿瘤表达的肿瘤相关抗原(TAA)，并向该哺乳动物胃肠外给予治疗有效量 的携带编码TAA的基因的辛德毕斯病毒载体，使所述哺乳动物足以引起针对所述肿瘤的免 疫应答，从而治疗所述肿瘤。
[0008] 另一方面，本发明提供一种在哺乳动物中诱导针对肿瘤的CD8+T-细胞介导的免疫 应答的方法，所述方法包括以下步骤:鉴定至少一种由该肿瘤表达的肿瘤相关抗原(TAA)， 和向需要此类治疗的哺乳动物以有效引起针对肿瘤的CD8+T-细胞介导的免疫应答的量胃 肠外给予携带编码TAA的基因的辛德毕斯病毒载体。
[0009] 根据本说明书、权利要求和附图，本发明的这些及其它方面对于本领域普通技术 人员将是明显的。
【附图说明】
[0010] 图Ia-Ic · SV/LacZ抑制表达LacZ的CT26 · CL25肿瘤的生长。（a)将0 · 5 X IO6的表达 LacZ的CT26.CL25(左图）或LacZ阴性CT26.WT(右图）细胞皮下（s.c.)注射到BALB/c小鼠的 右胁腹。肿瘤接种后第9天开始，用SV/LacZ、对照SV/Fluc载体或培养基(假处理(Mock))腹 膜内处理小鼠。测量肿瘤体积(mm 3)并绘图（N=3-4)。数据代表至少两次独立的实验。（b)腹 膜CT26 · CL25荷瘤小鼠的Kaplan-Meier存活图。将2 · 5 X IO4的CT26 · CL25细胞腹膜内注射并 在第4天开始处理(N=S)t3SVAacZ和假处理组的数据代表2次独立实验。（c)示出经SV/LacZ 和对照处理的CT26.CL25.Fluc肺荷瘤小鼠的代表性IVIS图像(左图）。相对肿瘤生长(右上 图）通过将各个体小鼠的发光标准化至第一图像(第2天)来测定，并对存活率作图（右下图） (N = 5-8)。数据代表至少两次独立的实验。（a)和（c)中的数据表示为平均值土SEM.*p〈 0 · 05**p〈0 · 01。SV，辛德毕斯病毒载体。
[0011] 图2a-2c. TAA表达和T细胞活化在纵膈淋巴结中发生。（a)皮下CT26. CL25荷瘤小鼠 (左图）或无瘤小鼠（右图）用SV/Fluc.腹膜内处理。在第5次（左图）或第1次(右图）处理后3 小时，拍摄生物发光图像来监测来自载体的Fluc表达。为了确定上身信号的来源，提取MLN 并单独成像(右图）。左图中的红色圈表示各小鼠中皮下瘤的位置。（b)CT26.CL25.Fluc肺荷 瘤小鼠用SV/LacZ处理。24小时后，提取纵膈和腹股沟淋巴结并染色，以确定T细胞(CD3阳 性，MHC II类阴性)在淋巴结中的百分比。示出代表性图（左图）及其定量(右图；11 = 3)。（(：） 分析在腹膜内SV/LacZ注射后24小时从肺荷瘤小鼠的纵膈和腹股沟淋巴结提取的CD8+T细 胞上CD69的表达。示出代表性流式细胞图（左图）、和示出CD69高的细胞的百分比的柱状图 (右图；n = 3) Jb)和（c)中的数据代表两次独立的实验（第二实验在腹膜内荷瘤小鼠中完 成），并表示为平均值土 SEMjpW. 05#p〈0.01 Jluc，萤火虫荧光素酶;MLN，纵膈淋巴结； ILN，腹股沟淋巴结;S/L，SV/LacZ(SV，辛德毕斯病毒载体）；TAA，肿瘤相关抗原。
[0012] 图3a和3b. SV/LacZ诱导强烈的CD8+T细胞应答。（a)CT26. CL25 .Fluc肺荷瘤小鼠用 SV/LacZ或培养基(假处理)处理。7天后，分析腹膜细胞。示出代表性流式细胞图（左图）、和 CD8+T细胞计数（右图）（平均值土ΒΕΜ,Νζβ)。^)使用NKG2D和L-选择素（L-selectin)作为 活化标志物进一步分析来自腹膜和肺的CD8+T细胞以确定它们的活化状态。示出代表性流 式细胞图（左图）和活化的(NKG2D高，L-选择素低)细胞的计算百分比（右图）（平均值土SEM， ~=3)。吨〈0.05*吨〈0.01。5￥，辛德毕斯病毒载体。
[0013] 图4a_4d.SV/LacZ诱导LacZ-特异性CD8+T细胞应答。（a，b)SV/LacZ或假处理开始 后2周收集并分析来自CT26.CL25皮下荷瘤小鼠的脾细胞。示出代表性四聚物图（a)、和四聚 物阳性细胞的百分比(13)0=5)。（幻治疗开始后7天收集、染色并分析来自腹膜内和肺荷瘤 小鼠的腹腔的细胞0 = 4-5)。（(1)开始处理后7天分析来自肺荷瘤小鼠的肺，并分析在肺中 的LacZ四聚物阳性和阴性的CD8+T细胞亚群中活化的（NKG2D高，L-选择素低）细胞的百分 比，并绘制为图31^0 = 3)。（13)-((1)中的数据表示为平均值土SEM.*p〈0.05#p〈0.01.SV，辛 德毕斯病毒载体。
[0014] 图5a和5b.淋巴细胞在SV/LacZ治疗期间获得LacZ特异性细胞毒性。假处理（-)、 SV/GFP(G)或SV/LacZ(L)处理开始后7天从CT26.CL25.Fluc肺荷瘤小鼠提取肺淋巴细胞。所 提取的肺淋巴细胞与 CT26.CL25.Fluc 细胞（CT26.CL25)或 CT26.WT.Fluc 细胞（CT26.WT)共 培养2天，以确定(a)肺淋巴细胞对各肿瘤细胞群的细胞毒性，和(b)，对如材料和方法部分 记载的与各肿瘤细胞群的共培养作出应答的来自肺淋巴细胞的IFN-γ分泌（(a)和(b)中的 数据表示为平均值土30』=3)。*邙〈0.01(显著不同于假处理）。10，未检出。5￥，辛德毕斯 病毒载体。
[0015] 图6a-6c.CD8+T细胞对于增强SV/LacZ治疗效果是必要的。比较(a)皮下、（b)腹膜 内和(c)肺肿瘤模型中完整的和⑶8+T细胞去除（⑶8+T细胞(-))小鼠之间SV/LacZ的治疗效 果。（a)在规定时间点测量CT26.CL25皮下肿瘤的大小并对各组作图（N = S)Jb)监测 CT26.CL25腹膜内荷瘤小鼠的存活率并绘制为Kaplan-Meier存活图。N = 8-9(c)分析 CT26.CL25. Fluc肺荷瘤小鼠的肿瘤生长（左图）和存活率（右图）。如图Ic定量相对肿瘤生 长，并以Kaplan-Meier存活图示出存活率(N = 5)。（a)和(c)中的数据表示为平均值土SEM。* 卩〈0.05，*扑〈0.01。13，不显著;3￥，辛德毕斯病毒载体。
[0016] 图7a_7e .对内源CT26TAA的免疫在SV/LacZ治疗期间发展。（a，b)假处理(-)、SV/ GFP(G)或SV/LacZ(L)处理开始后7天从CT26.CL25皮下荷瘤小鼠提取脾细胞。所提取的脾细 胞与 0'26.0^5.?111(3((^26.(^25)或(^26.11'上111(3((^26.11')细胞共培养2天，以确定(3)脾 细胞对各肿瘤细胞群的细胞毒性，和(b)对如材料和方法部分记载的与各肿瘤细胞群的共 培养作出应答的来自脾细胞的IFN-γ分泌(平均值±30少=3). (c)在SV/LacZ最终处理后 超过60天，将CT26. WT. Fluc肿瘤静脉（i . V.)接种至无处理的(naiVe)和CT26. CL25SV/LacZ-处理的肿瘤-治愈小鼠，并通过生物发光成像在规定时间点分析肺中的肿瘤生长。左图示出 2次独立实验的代表性IVIS图像。右图示出在规定时间点肿瘤生物发光的定量(平均值± SEM少=8)。（(1)在SV/LacZ最终处理后超过30天，CT26. WT. Fluc肿瘤静脉接种至无处理的和 SV/LacZ-处理的肿瘤-治愈小鼠（S)。肿瘤接种后8天，从各小鼠提取脾细胞并用LacZ、gp70、 或对照肽培养3天。培养后，如材料和方法部分所记载的，分析IFN- γ分泌的LacZ-或gp70- 特异性诱导(平均值土 SEM，N = 3)。（ e)使用gp70四聚物通过流式细胞术定量(d)中提取的脾 细胞中gp70-特异性CD8+T细胞数(平均值土 30少=3)。吨〈0.05，*邙〈0.01(显著不同于假处 理或无处理）。N. D，未检出；SV，辛德毕斯病毒载体。
[0017] 图8. SV/TAA治疗期间CD8+T细胞活化的四步模型。步骤I: SV/LacZ的腹膜内注射导 致纵膈淋巴结中LacZ的瞬时免疫原性表达(深蓝色箭头），接着在该部位和/或备选的位置 诱导T细胞活化(浅蓝色箭头）。疆细胞也针对肿瘤细胞活化(褐色箭头）。步骤2(红色箭头）： LacZ-特异性CD8+T细胞的细胞毒性导致肿瘤细胞被破坏，以及肿瘤相关抗原如LacZ和gp70 随后释放。步骤3(绿色箭头）：抗原呈递细胞捕获这些抗原并将其呈递至肿瘤引流淋巴结中 的⑶8+T细胞，导致表位扩散，包括可潜在地靶向LacZ(-)肿瘤细胞逃逸变体的gp70-特异性 ⑶8+T细胞的诱导。步骤4(紫色箭头）：产生针对多种肿瘤相关抗原的记忆⑶8+T细胞。APCJA 原呈递细胞;LN，淋巴结;MLN，纵膈淋巴结;NK，自然杀伤细胞；SV，辛德毕斯病毒载体;TAA， 肿瘤相关抗原;Tc，细胞毒性⑶8+T细胞;Tm，记忆⑶8+T细胞。<