一种表达hiv抗原的重组载体疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗病毒免疫学领域，具体地，本发明涉及一种表达HIV抗原的重组载 体疫苗及其构建方法和用途。
【背景技术】
[0002] 获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人免 疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV)侵入人体后借细胞表面的⑶4分子及 某些趋化因子受体侵犯宿主细胞，破坏机体免疫功能，进而引起严重的机会性感染所致的 以恶性疾病为特征的继发性免疫缺陷综合征。据统计数据显示，截止2012年全球艾滋病总 感染人数已超过3500万，超过法国总人口的一半，其中2012年新增感染人数230万，因艾 滋病死亡人数约为160万。中国艾滋病的感染与发病人数也已由低速增长期进入高速增长 期。HIV流行给人类带来了巨大的疾病负担，因此迫切需要高度有效而又安全的疫苗来应对 这一难以对付疾病的挑战。
[0003] 有效的HIV疫苗能诱导持久的免疫，并能阻止感染发生、减少病毒复制、延缓病情 进展和降低病毒传播。然而至今尚无理想的HIV疫苗。预防性HIV疫苗进展缓慢：已有3种 预防性疫苗完成了 III期临床，但临床结果显示这三种疫苗均不具有广泛的预防作用。针 对目前HIV有效预防性疫苗的缺失及严峻的发病形势，治疗性疫苗应运而生。
[0004] 治疗性疫苗属于基因治疗的范畴，同时它在体内发生作用的机制与免疫应答相 关，因此又属于疫苗范畴。因此，治疗性疫苗具有基因治疗药物和疫苗的双重属性。治疗性 疫苗的作用机制主要是激发机体免疫系统，使患者免疫功能恢复正常或接近正常水平，主 要应用于已感染HIV的人群。
[0005] 目前进行临床研究的HIV治疗性疫苗类型包括亚单位疫苗、DNA疫苗以及重组载 体疫苗。重组载体疫苗是将HIV病毒蛋白的编码基因插入到一个无害或弱的病毒或细菌 中，其进入机体后会产生相应抗原，诱发机体产生细胞免疫或体液免疫反应。目前，使用的 载体系统主要是病毒载体系统，约占总量的70%，已批准的临床方案及已上市的药物绝大 部分使用的是腺病毒和腺相关病毒，也使用过逆转录病毒和其它非病毒载体系统。
[0006] 腺病毒载体是一种应用最为广泛，研究也较为深入的载体系统，可以感染包括分 裂期和非分裂期的宿主细胞，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此不会发生由于病毒 基因组整合而导致的细胞癌变，。该病毒可以较容易地制备出高滴度的病毒样品，有利于产 品的生产和临床使用，生产成本相对也较低。但是，由于该类载体表达持续时间相对较短， 因此，实际使用时所需的剂量较大，对细胞和机体的损害也比较明显，容易引起机体的免疫 反应，重复给药时疗效较差；腺相关病毒没有致病性，虽然可以整合到染色体上，但整合概 率很低，至今没有发现其整合可以引起细胞转化的证据，被公认为是一种安全的病毒载体 系统，该系统在基因治疗领域的应用逐年增多。但是，腺相关病毒存在外源基因容量小、制 造工艺相对复杂和对外源基因的表达量低等缺点。逆转录病毒载体是最早使用的载体系统 之一，人类第一例基因治疗临床试验就是使用的该类载体，它具有感染和整合效率高、可持 续表达目的基因等优点，但也有一个致命的缺点，那就是安全性欠佳，其在核染色体上的高 整合率有可能引起癌基因的活化或抑癌基因的失活，由此引起癌变。
[0007] 仙台病毒载体是新近开发出来的载体系统，具有独特的优势，其安全、高效和广泛 的宿主范围使其具有很好的应用前景。
[0008] 仙台病毒基因组是一条负链RNA，长度为15384个核苷酸，共包括6个基因。核蛋 白 NP(nucleoprotein)、憐酸化蛋白 P(phosphoprotein)、聚合酶大亚基 L (large protein) 和RNA共同构成核蛋白复合物RNP。基质蛋白M(matrix protein)用于病毒颗粒的组装。 血凝素神经氨酸酶HN(hemagglutinin-neuraminidase)和融合蛋白 F(fusion protein)是 位于病毒胞膜上的糖蛋白，主要参与病毒粒子与宿主细胞的吸附和侵入等过程。
[0009] Leader(ld)和trailer(tr)分别是仙台病毒基因组中特有的前导序列和末端 序列。六个基因头尾相连排列在基因组中，每一个基因作为一个表达单元（开放式阅读 框），其中又可以分为几个独立的区域，分别是基因起始区域GS (Gene Start)、不转录区域 UTR (Untranslate region)和基因结束区域 GE (Gene End), I(intergenic motif)是重复 的3bp片段排列在基因和基因的连接处。
[0010] 仙台病毒的包装过程：pSeV质粒进入细胞后，在辅助病毒vTF7-3(Fuerst，T. R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126, 1986) T7 聚合酶的作用下开始复制正链 RNA， 在辅助质粒pTM-N、pTM-P和pTM-L合成的N、P和L蛋白的作用下复制成负链RNA，也就是 仙台病毒基因组，然后开始表达Μ蛋白，HN蛋白，F蛋白，并最终包装成完整的病毒颗粒，以 出芽形式形成具有感染能力的仙台病毒。
[0011] 随着反向遗传学技术的发展，仙台病毒被开发为胞质表达传播缺陷性的病毒载 体，临床前研究已证实其携带外源基因对某些疾病，如呼吸道疾病、缺血性损伤和肿瘤等具 有很好的治疗作用。
[0012] 由于仙台病毒属于负单链RNA病毒，病毒的复制和组装等全部生活周期均在细胞 质中完成，复制时也没有DNA链合成过程，而仅以其本身为模板进行正、负链RNA的合成和 转录翻译，尚没有发现其具有整合进入细胞核DNA中的机制和迹象，因此使用起来有较大 的安全保障，解决了长期以来基因治疗中产生的安全性问题；其次，由于该病毒外膜含有仙 台病毒所特有的F蛋白，因此可以高效地将其RNP转入细胞，复制转录后产生足够的目的蛋 白产物，来达到治疗的目的；另外，由于其感染效率高，使用剂量小，因此治疗过程中由病毒 本身引起的副作用要比其它载体系统小得多，安全性更高；目前已经发现，仙台病毒可以感 染包括肌细胞、神经细胞和上皮细胞在内的几乎所有类型的细胞，这一特点使其应用面进 一步拓宽，可被广泛用于基因治疗和基因免疫等各个领域。
[0013] 实际应用过程中，将野生型病毒的F基因去除，使其成为F基因缺陷型病毒，并将 目的基因插入到病毒基因组中，得到重组病毒。用于治疗时，载体将目的基因带入细胞，进 行复制和表达，但不能形成有感染活性的子代病毒颗粒，不能进一步感染周围其他的细胞， 由此来限制病毒的扩散，达到控制药物剂量，提高生物安全性的目的。病毒载体的生产则使 用可表达F蛋白的包装细胞来进行，通过反式互补来生产有感染活性的病毒颗粒。该病毒 基因组中仍然缺乏F基因，用于治疗时，在正常细胞中不能形成有感染活性的颗粒，因此没 有传播危险。
[0014] 目前，进行仙台病毒载体生产大多采用表达F蛋白的包装细胞系LLC-MK2/F。 LLC-MK2/F细胞为LLC-MK2细胞改造而来，通过在LLC-MK2细胞基因组中插入F基因获得。 F基因缺陷型仙台病毒载体转染LLC-MK2/F细胞后，该细胞可稳定表达F蛋白，从而通过反 式互补来生产有感染活性的仙台病毒颗粒。
[0015] gag基因是HIV的结构基因，其编码蛋白在病毒组装过程中必不可少。在细胞质 中，gag基因产生的mRNA翻译形成55kD的多蛋白复合体。多蛋白复合体形成后迅速移至 细胞膜区域，帮助形成病毒粒子。gag基因常作为HIV疫苗的抗原基因。进入III期临床的 RV144疫苗项目和MRKAd5 HIV-1 (B亚型）gag/pol/nef三价疫苗均采用gag基因作为抗原 基因。另一种普遍采用的抗原基因为env基因，第一个进入III期临床的AIDSVAX gpl20 亚单位疫苗即采用env基因编码蛋白gpl20亚单位作为抗原。病毒表面的gpl20蛋白为糖 蛋白，表面被密集的多糖覆盖，他与宿主细胞受体（CD4)的结合位点通常被隐蔽，而避免与 中和抗体的结合。此外，gpl20分子量较大，发生突变性几率高，很容易出现免疫逃逸。
[0016] 与env抗原基因相比较，以gag为抗原基因具有一定的优势，其编码产物相对保 守，变异频率较gpl20低；具有多个抗原表位，能诱导机体的细胞免疫反应。
[0017] 目前，国外用于临床前研究的HIV疫苗大多是以欧美及非洲的流行株为基础构建 的，不适合在我国应用，因而有必要研制以我国流行株为基础的HIV疫苗。
【发明内容】
[0018] 本发明的目的在于提供一种表达HIV抗原的重组仙台载体疫苗及其构建方法和 应用，所述HIV抗原是以我国HIV流行株为基础获得。
[0019] 为实现上述发明目的，本发明提供