一种猪蓝耳病重组疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和生物医药技术领域，具体涉及一种猪蓝耳病重组疫苗。
【背景技术】
[0002]猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸综合症”，是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)感染引起的以怀孕母猪繁殖障碍及各年龄段猪呼吸道疾病为主要特征的猪传染病。猪蓝耳病是一种在猪群中大范围流行的疾病，在许多国家都有发现且影响着全世界养猪业和食品的安全。因其是危害养猪业最严重传染病之一，现已被国际兽医局列为B类传染病，我国将其列为二类传染病。目前猪蓝耳病已遍布全球主要养猪国家和地区，给全球养猪业造成了巨大经济损失，对我国养猪业危害也极其严重。
[0003]传统疫苗的应用为我国动物疫病的防控做出了巨大贡献，目前依然是我国控制动物传染病的主要手段。目前针对高致病性猪蓝耳病的疫苗有灭活苗和活疫苗两种，2008年及以前，国内主要是采用灭活苗进行防疫，从2009年4月底，农业部开始批准了第一批共计4家企业生产高致病性蓝耳病活疫苗(JXAl-R株)，活疫苗开始进入试点使用。两种疫苗各有优势，在免疫实践中，往往是针对不同的猪以及疫情情况使用不同的疫苗。根据农业部《2010年国家动物疫病强制免疫计划》，对商品猪和种母猪可选用灭活苗或活疫苗进行免疫，而种公猪选用灭活苗进行免疫。
[0004]但是，由于我国已经投入商品化的活疫苗毒株有很多种，造成我国猪场多种毒株同时存在的复杂情况，现有的疫苗鉴别诊断方法均无法从血清学上对疫苗免疫和野毒感染的猪进行区分，从而给疫病的防控和清除造成巨大的困难。而且目前我们仍未研究清楚能刺激产生保护性免疫的PRRSV抗原，不能有针对性的选取病毒免疫原来制备疫苗；而PRRSV是RNA病毒，病毒基因突变频率高，病毒蛋白抗原性多变，容易产生变异株逃逸免疫识别等诸多原因，传统的猪蓝耳病疫苗并不能达到很好的免疫效果。因此，研发一种能在血清学上区分疫苗免疫和野毒感染的新型安全高效的疫苗是必然趋势。
[0005]基因工程疫苗以其安全性好、质量均一、生产成本低、适合开发多价苗和联苗等诸多优点，成为新型疫苗的研究焦点和开发方向。猪蓝耳病病毒0RF5基因上包含T细胞、B细胞抗原决定簇，且其编码的GP5蛋白具有诱导产生中和抗体的能力，同时0RF5能引起细胞免疫应答。越来越多的证据表明0RF5基因是开发猪蓝耳病新型疫苗的首选靶基因。然而，目前许多实验结果表明利用0RF3基因编码的GP3蛋白开发的新型疫苗虽然检测不到抗猪蓝耳病病毒的中和抗体，但是对妊娠母猪的繁殖障碍可以提供部分保护。并且许多研究表明0RF5基因和0RF3基因串联的新型疫苗可以提供更好的免疫效果。但是，针对猪蓝耳病的有效基因工程疫苗还未上市，更不要说可饲的基因工程疫苗。因此，利用生物反应器开发可饲疫苗非常具有开发价值。
[0006]生物反应器是利用转基因技术或代谢调控技术在生物个体生产高附加值蛋白质和代谢产物，或者改造植物某种功能成分使之更适于人类利用的一种生物制药和蛋白生产技术。其中，被称为“天然生物反应器”的植物表达体系正在引起工业和医学界越来越多的关注，目前已成为生产高附加值的口服疫苗、医用蛋白、单克隆抗体的重要途径，是国外生物产业的研发热点之一。但目前动植物生物反应器仍然存在转基因困难、生长周期长、分离纯化困难、成本高及因担心基因漂移而造成的环境释放困难等问题。食药用真菌生物反应器作为动植物生物反应器的完美补充，具有基因转化容易、生长周期短、无需在室外环境中释放等优点，是具有重要开发价值的生物反应器受体系统。
【发明内容】
[0007]
本发明的目的是提供一种融合基因PCB130NG-0RF3-0RF5及一种猪蓝耳病重组疫苗。
[0008]一种融合基因0RF3-0RF5，它的碱基序列如序列表SEQ ID N0.4所示。
[0009]一种融合蛋白0RF3-0RF5，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.5所示。
[0010]一种表达载体 pCB130NG-6^/^-6i/^5.，它是:
1)用Hindill和EcoRi双酶切pCAMBIA1300载体，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体PCB130-1 ;
2)在pCB130-l的Sphl位点处引入SEQID N0.1所示的基因，包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体PCB130-2 ;
3)PCB130-2分别在Pstl酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD，在Sad与EcoRV酶切位点之间引入Afes终止子，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为pCB130NG ;
4)经^和Kpnl酶切，在pCB130NG中插入SEQID N0.4所示的基因。
[0011]—种猪蓝耳病重组疫苗，它是在食药用真菌的原生质中转染了一种表达载体pCB 130NG- 0RF3-0RF5,培养转基因菌丝；
所述的转基因菌丝经液体培养基发酵后，离心收集菌丝，烘干或冻干后，粉碎；
所述的食药用真菌为虫草、灵芝、金针菇或平菇。
[0012]本发明提供了一种猪蓝耳病重组疫苗，将猪蓝耳病病毒0RF3基因和0RF5基因串联，构建了融合基因0RF3-0RF5，插入真菌特异性双T-DNA安全表达载体pCB130NG中，获得一种表达载体pCB130NG-ft?/^-ft^5.，利用PEG法、农杆菌介导法或电击法转化食药用真菌原生质体，经鉴定为阳性的菌丝体，培养获得Tl代子实体，利用PCR筛选出只含目的基因而不含选择标记基因的子实体个体，培养至T2代，获得稳定表达猪蓝耳病病毒基因的转基因食药用真菌。通过转基因真菌菌丝的发酵培养，离心收集菌丝，烘干或冻干后，粉碎制备猪蓝耳病重组疫苗。利用本发明生产的猪蓝耳病疫苗各批次间质量差异小、产量大、成本低，且可以直接通过口服饲喂动物，具有广泛的社会效益和经济效益。
【附图说明】
[0013]图1真菌特异性双T-DNA安全表达载体pCB130NG示意图；
图2 pUC57-0RF3-0RF5载体酶切结果；
图3 pCB130NG-0RF3-0RF5转化后菌液PCR及质粒酶切结果；
图4转基因蛹虫草菌丝的PCR检测；
图5转基因蛹虫草的PCR检测；
图6 GP3、GP5特异性抗体水平检测结果； 图7攻毒后小鼠直肠温度的测定；
图8攻毒后小鼠各组织器官中病毒的积累。
【具体实施方式】
[0014]实施例1.真菌特异性双T-DNA安全表达载体的构建
利用PCAMBIA1300载体作为基础载体，首先通过历λΛΙΙ和EcoRi双酶切，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用Τ4连接酶连接形成中间载体pCB130_l。接下来，通过基因合成技术在中间载体的办Al位点处引入一段序列(SEQ ID N0.1)，包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体PCB130-2。在此载体基础上，通过PCR技术及酶切与连接方法，分别在Pstl酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD (SEQ ID N0.2)，在Sad与EcoRV酶切位点之间引入终止子(SEQ ID N0.3)，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为PCB130NG，该载体示意图见图1。
[0015]实施例2.融合猪蓝耳病疫苗基因0RF3-0RF5的设计
为了提高GP3与GP5蛋白片段的免疫活性，将0RF3基因与0RF5基因串联一起进行构建，并且在两个蛋白片段中间插入LTB佐剂序列增强免疫效力；同时为使三个蛋白片段表达后在空间上隔开，在两个基因中间插入Linker ;为便于表达后的检测，在0RF3基因的5’端和0RF5基因的3’末端加上His标签。得到的融合免疫蛋白GP3-GP5的氨基酸序列为SEQ ID N0.5 序列 ο
[0016]实施例3.融合基因0RF3-0RF5真菌表达载体的构建
猪蓝耳病病毒0RF5基因和0RF3基因为Genebank中已公布的基因序列(GenBank:ACF93752.1和ACF93750.1)。根据真菌对密码子的偏爱性对融合基因进行密码子优化后，通过人工合成方法合成SEQ ID N0.4，将该序列合成到载体pUC57上，并在序列两端添加酶切位点ZAaJ和Kpnlo
[0017]将PUC57-0RF3-0RF5载体和本研究组改造后的真菌特异性表达双T-DNA安全表达载体PCB130NG (图1)，分别用^和Kpnl酶切(图2)，回收酶切产物后，经连接、转化、鉴定(图3)，获得融合基因0RF3-0RF5真菌表达载体pCB130NG -0RF3-0RF5。<