一种hcv多表位肽与截短型ns3、dc活化分子eda重组蛋白疫苗及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白及其应用，该重组蛋白疫苗包括以下EDA，ΔNS3以及3个HCVmulti-epitopes：其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。HCVEDA-ΔNS3-VAL-44蛋白可以诱导出特异性的体液免疫应答以及T细胞免疫应答，T细胞经过特异性抗原刺激以后可以迅速产生IFN-γ并产生高效的CTL，该种HCV多表位肽及其与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗可能是较理想的HCV预防/治疗性候选疫苗。
【专利说明】—种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于HCV疫苗【技术领域】，涉及一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗及其应用。
【背景技术】
[0002]丙型肝炎病毒(h印atitis C virus，HCV)，为黄病毒属的单股正链嗜肝RNA病毒，是引发慢性肝病的主要病原体，全球约有1.7亿感染者，发病人数以每年三百万速度递增。慢性HCV感染与肝硬化和肝癌直接相关，严重影响患者生活质量。由于HCV标准治疗方案费用高昂，疗效不理想使得发展中国家大多数HCV感染患者难以承受。因此研发HCV疫苗成为降低HCV所引发的肝硬化，肝癌发生率最为有效的策略之一。
[0003]HCV基因组分别编码核心蛋白C，包膜蛋白El、E2，p7和6种非结构蛋白(NS2、NS3，NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但由于HCV病毒RNA聚合酶缺乏校对功能，病毒变异率高，尤其是位于包膜糖蛋白E2的中和抗原位点存在高变区，传统的以产生保护性抗体为主的疫苗研发面临重重困难。
[0004]研究表明，急性病患体内多特异性CTL可以使病情逐渐转归、自愈。慢性HCV病人T细胞应答虽然具有多克隆以及多特异性，但强度远不如急性病人的免疫应答强烈，相对较弱的抗HCV免疫应答导致病毒难以被清除。与此同时，肝内大量的HCV特异性CD8+T细胞分泌Y干扰素的水平受到抑制，因此，慢性HCV感染时CD8+T细胞功能障碍是造成免疫系统不能控制HCV复制，导致疾病慢性化的主要原因。
[0005]近10年来，对HCV感染发病机制、保护性免疫应答和病毒持续感染机制的认识取得了较大进展。中和抗体以及CD4+和CD8+T细胞所引发强烈的T细胞免疫应答已被证明与HCV的清除相关，这将是研制丙型肝炎疫苗的希望所在。
[0006]大量证据表明，HCV非结构蛋白介导的持续性、强烈的、多特异性的Thl型细胞免疫应答水平直接关系到病毒是否能被清除以及疾病的预后。由于大多数慢性患者HCV亚型的差异，成功的疫苗应该诱导产生强烈的多特异性免疫应答，包括CD4+及CD8+T细胞免疫应答。因此，HCV表位疫苗更倾向于选取保守区域。
[0007]本研究前期将筛选出的HCV 2个CTL表位:NS5A(1991-1999) VLSDFKVWL以及NS4B (1793-1801) SMMAFSAAL,加入一个通用 Th 表位 KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL 进行了不同的组合，包括是否含有Th表位，共合成了 8条不同排列组合方式的多肽，经过小鼠体内试验，合成肽与HLA-A*0201相对亲和力和稳定性检测以及与HCV病人PBMC相作用3部分实验初步确定了 VLSDFKVWLKKKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLKKSMMAF
SAAL (简称VAL-44)这种排列组合方式效果最优，将这种HCV多肽疫苗皮下免疫HHD-2小鼠后，可以引起脾细胞增殖，⑶4+、⑶8+T淋巴细胞百分比增高以及以Thl型反应为主的细胞免疫应答，但总体来说，免疫效果尚不十分理想，为了克服肽疫苗免疫源性较弱的缺陷，我们最终选择了纤连蛋白外部结构域A (Fibronectin Extra Domain A,EDA),联合截短的NS3插入到3个多表位的上游，构建起EDA-ANS3-VAL-44原核表达载体，经过诱导蛋白表达，纯化得到EDA- A NS3-VAL-44目的蛋白，辅以能够活化To 11样受体 3 的免疫佐剂 poly (1: C) (Yu-sheng Cheng and Feng Xu.Anticancer function ofpolyinosinic-polycytidylic acid.Cancer Biology & Therapy.2010;10:1219-1223)对小鼠进行免疫。 [0008]纤连蛋白外部结构域A (Fibronectin Extra Domain A, EDA)是一种DC活化因子，主要起着募集DC并激发其成熟的作用；EDA通过与Toll样受体4相互作用产生共刺激因子，使DC迁移至淋巴结，辅助DC发挥较强的摄取加工抗原的作用，并诱导DC成熟，从而激活抗病毒以及抗肿瘤的T细胞应答(Mansilla C，Gorraiz M, Martinez M, CasaresN， Arribillaga L, Rudilla F， et al.1mmunization against hepatitis C viruswith a fusion protein containing the extra domain A from fibronectin and thehepatitis C virus NS3 protein.Journal of Hepatology.2009; 51:520-7.)? 由于DC细胞的成熟是效应T细胞启动的必要环节，目前多种活化DC的分子成为疫苗研发的热点。近几年，相继有将抗原与不同促DC成熟刺激物混合的免疫策略，并发现在这些刺激物的作用下可以激发更为显著的免疫应答(Liu QH, Bohlen H，Titzer S，Christensen0, Diehl V, Hescheler J, et al.Expression and a role of functionally coupledP2Y receptors in human dendritic cells.FEBS Lett.1999;445:402-8.和 SchwarzK, Storni T, Manolova V, Didierlaurent A, Sirard JC, Rothlisberger P, et al.Role of Toll-like receptors in costimulating cytotoxic T cell responses.Eur JImmunol.2003;33:1465-70.和Resta R, Yamashita Y, Thompson LF.Ecto-enzyme andsignaling functions of lymphocyte CD73.1mmunol Rev.1998;161:95-109.X
[0009]HCV NS3蛋白编码基因全长共1893个核苷酸。截短的NS3是编码丝氨酸蛋白酶区域，该区域在多聚蛋白前体的加工和成熟方面起着非常重要的作用。针对NS3的CD4+T细胞免疫应答能够有效刺激IFN- y的生成，增强对IFN- a治疗的敏感性，与HCV感染的自限性和良好转归密切相关。有研究发现，14例HCV感染患者中的8例自限性患者均具有NS3特异性免疫应答，而65例发展为慢性丙型肝炎的患者中仅有5例具有NS3特异性免疫应答，提示抗NS3免疫应答与病毒的清除相关(Di印older HM, Zachoval R, HoffmannRM, Wierenga EA, Santantonio T, Jung MC, et al.Possible mechanism involvingT-1ymphocyte response to non—structural protein 3 in viral clearance in acutehepatitis C virus infection.Lancet.1995; 346:1006-7.)? 目前已证实，ANS3 上集中了多个 T 细胞表位(如 NS3 1073-1081，HCV NS3 1038-1047，NS3 1100-1107 等)，因此它也是HCV疫苗研发中备受重视的主要靶点抗原之一。
【发明内容】
[0010]本发明解决的问题在于提供一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗及其应用，该重组HCV蛋白疫苗可以诱导出特异性的体液免疫应答，以及特异性细胞免疫应答，包括特异性CTL发生，T细胞经过特异性抗原刺激以后可迅速产生IFN- y o
[0011]本发明是通过以下技术方案来实现:一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗，其特征在于:包括以下纤连蛋白外部结构域A，ANS3以及VAL-44:其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
[0012]所述的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗在制备针对丙型肝炎病毒的预防性/治疗性疫苗的应用。
[0013]所述的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗的构建在制备抗丙型肝炎病毒的药物中的应用。
[0014]所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的体液免疫应答的药物。
[0015]所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的细胞免疫应答的药物。
[0016]所述的药物为刺激分泌IFN-Y的细胞增殖的药物。
[0017]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
本发明提供的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗，采用前期经体内、外试验筛选出的3个HCV多表位最优的排列组合方式，为了使所设计的疫苗可以使靶抗原被树突状细胞所递呈，引发强烈的体液、细胞免疫应答，特在3个多表位上游引入EDA以及经截短的NS3。经体内试验表明该蛋白疫苗具有强的免疫原性，表现出了良好的免疫效果包括:
可以诱发机体产生特异性体液免疫应答；
可以诱导出特异性的T细胞免疫应答；
经过 特异性抗原刺激以后可以迅速产生IFN-Y ；
该HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗疫苗可能是较理想的HCV预防/治疗性候选疫苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为pET32a载体的示意图；
图2为重组质粒pET32a-EDA-ANS3-VAL-44酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳后的成像图； 图3为HCV EDA-ANS3-VAL-44蛋白原核表达的可溶性分析图；
图4为HCV EDA-A NS3-VAL-44蛋白的纯化结果图；
图 5 为 Western blot 法鉴定 HCV EDA-A NS3-VAL-44 蛋白结果图；
图6 HCV疫苗免疫程序示意图；
图7为ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体效价结果；
图8为各组免疫小鼠CTL活性检测比较；
图9为ELISP0T法检测小鼠脾细胞分泌IFN-Y情况；
图10为ELISP0T法检测小鼠脾细胞分泌IFN-Y情况统计图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0020]在HCV的表位中筛选的3个表位串联，并在其上游插入EDA以及截短的NS3，通过构建的原核表达载体对大肠杆菌BL21进行转化、诱导，纯化出HCV EDA- A NS3-VAL-44目的蛋白作为疫苗进行免疫，以达到针对HCV的免疫效果，从而达到预防/治疗性丙型肝炎的目的，这些免疫效果包括:引发包括体液免疫应答，引发分泌IFN-Y细胞因子为主的细胞免疫应答及特异性的CTL反应。
[0021]1、鉴于上述目的，首先进行一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗的构建。
[0022]具体的基因为:
该目的基因由三部分组成，包括EDA，A NS3以及3个HCV多表位。3个多表位按照:NS5A( 1991-1999)-KK-Th表位-KK- NS4B(1793-1801)顺序排列。为了使所构建的蛋白疫苗靶向递呈至树突状细胞，特在上游插入EDA，所选择截短的NS3是编码丝氨酸蛋白酶的序列。
[0023]N0.1:HCV EDA-A NS3-VAL-44 核苷酸序列 AACATTGATCGCCCTAAAGGACTGGCATTCACTGATGTGGATGTCGATTCCATCAAAATTGCTTGGGAAAGC
CCACAGGGGCAAGTTTCCAGGTACAGGGTGACCTACTCGAGCCCTGAGGATGGAATCCGGGAGCTTTTCCCTGCACCTGATGGTGAAGACGACACTGCAGAGCTGCAGGGCCTCAGGCCGGGGTCTGAGTACACAGTCAGTGTGGTTGCCTTGCACGATGATATGGAGAGCCAGCCCCTGATTGGAATCCAGTCCACAGCGCCCATCACGGCTTACTCCCAACAGACGCGGGGCTTGCTTGGTTGTATCATCACCAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAAGTCGAGGGGGAGGTTCAAGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGCGTCAACGGCGTGTGTTGGACCGTCTATCATGGCGCTGGCTCAAAGACCTTAGCCGGCCCAAAAGGCCCAATTACCCAAATGTACACTAATGTAGATCAGGACCTCGTCGGCTGGCCGGCGCCCTCTGGGGCGCGTTCCTTGACACCATGCACTTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGATATGCCGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGTGACAGTAGGGGGAGTCTACTCTCCCCCAGGCCTGTCTCCTACTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGCCCACTGCTCTGCCCTTCGGGGCACGCTGCGGGTATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGAGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTCGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACCATGCGGTCTCCGGTCTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTGCTGTCTGACTTCAAAGTCTGGCTCAAGAAAAAGTTTCCAGGCGGAGGGCAGATCGTGGGTGGCGTCTACCTGCTCCCCAGGAGAGGACCTCGGCTGAAAAAGAGCATGATGGCCTTCTCCGCCGCTCTCN0.2 =EDA的核苷酸序列
AACATTGATCGCCCTAAAGGACTGGCATTCACTGATGTGGATGTCGATTCCATCAAAATTGCTTGGGAAAGCCCACAGGGGCAAGTTTCCAGGTACAGGGTGACCTACTCGAGCCCTGAGGATGGAATCCGGGAGCTTTTCCCTGCACCTGATGGTGAAGACGACACTGCAGAGCTGCAGGGCCTCAGGCCGGGGTCTGAGTACACAGTCAGTGTGGTTGCCTTGCACGATGATATGGAGAGCCAGCCCCTGATTGGAATCCAGTCCACAN0.3: ANS3的核苷酸序列
GCGCCCATCACGGCTTACTCCCAACAGACGCGGGGCTTGCTTGGTTGTATCATCACCAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAAGTCGAGGGGGAGGTTCAAGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGCGTCAACGGCGTGTGTTGGACCGTCTATCATGGCGCTGGCTCAAAGACCTTAGCCGGCCCAAAAGGCCCAATTACCCAAATGTACACTAATGTAGATCAGGACCTCGTCGGCTGGCCGGCGCCCTCTGGGGCGCGTTCCTTGACACCATGCACTTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGATATGCCGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGTGACAGTAGGGGGAGTCTACTCTCCCCCAGGCCTGTCTCCTACTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGCCCACTGCTCTGCCCTTCGGGGCACGCTGCGGGTATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGAGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTCGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACCATGCGGTCTCCGGTCTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCN0.4:3个多表位核苷酸序列
GTGCTGTCTGACTTCAAAGTCTGGCTCAAGAAAAAGTTTCCAGGCGGAGGGCAGATCGTGGGTGGCGTCTACCTGCTCCCCAGGAGAGGACCTCGGCTGAAAAAGAGCATGATGGCCTTCTCCGCCGCTCTC
将编码纤连蛋白外部结构域A，截短的NS3以及所前期筛选的3个HCV表位的基因上下游分别插入EcoRI和Sal I两个酶切位点，目的基因序列经化学合成后与原核载体pET-32a(+ )载体(见图1)连接。重组pET-32a ( + )/HCV EDA-ANS3-VAL-44由南京金斯瑞生物科技有限公司构建并提供。
[0024]将含有目的基因的菌划线接种于含Amp抗性的LB平板上，37°C培养。次日挑取单菌落于含Amp抗性LB液体培养基中培养，采用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA。提取的质粒用EcoRI和Sal I于37 °C水浴进行3h双酶切。
[0025]酶切产物取10 Ul在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察并保存结果。阳性克隆应该切出大约978 bp的条带(见图2)，而载体的大小为5900 bp。图中广2为pET32a-EDA- A NS3-VAL-44经EcoRI和Sal I双酶切后的结果图，3是pET32a空载体对照，M是DNA marker.筛选出的含978 bp的阳性重组质粒送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司，用T7引物进行DNA测序加以确认。
[0026]2、诱导表达目的蛋白。以热休克法转化大肠杆菌BL21感受态细胞:取IOiU阳性重组质粒加入100 U I感受态DH5a中轻柔混匀在冰上放置30min，快速移至42°C水浴，热休克90s，勿摇动离心管，迅速冰浴2min。加入800 预温至37°C的LB培养基37°C，160 rpm/min缓摇40min左右使细菌复苏，并表达抗生素抗性基因。离心2，500gX5min，吸去700 U I上清，保留100 U I用于重悬沉淀。将细菌悬液分别涂于LB(Amp+)平板上，待液体完全吸收后，倒置平皿，于37°C培养12~16h，观察菌落。
[0027]挑选4个阳性克隆分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C振荡培养18h,分别取50uL加到5mL`含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C振荡培养2~3h，0.5M IPTG诱导4h，取ImL诱导表达菌液以及未诱导的菌液离心，回收菌体沉淀。将诱导前后的样本重悬到去离子水中，加入2 X SDS上样缓冲液，100°C沸水浴5min，12，OOOrpm离心lOmin，取10 u I上清进行SDS-PAGE，电泳条件为150V恒压。凝胶用考马斯亮蓝染色液染色2h，脱色液脱色f3h，观察目的蛋白表达条带以及表达产物的表达形式。
[0028]含pET-32a-EDA- A NS3-VAL-44质粒的重组菌经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析在相对分子量约为55kD处有明显的特异性蛋白表达条带，其大小与预测的目的蛋白的大小相符。表达的目的蛋白大多以可溶形式存在于上清中(图3)，图3为HCV EDA-ANS3-VAL-44蛋白原核表达的可溶性分析图。图中I是未经IPTG诱导的蛋白表达;M是低分子量蛋白marker ；2是经IPTG诱导的全细菌裂解物，3是经IPTG诱导的裂解上清，4是经IPTG诱导的裂解沉淀。
[0029]3、采用活性条件进行亲和层析法纯化蛋白。经N1-NTA亲和色谱柱上样洗脱，对洗脱液进行SDS-PAGE分析的结果表明获得了纯化的HCV EDA-ANS3-VAL-44融合蛋白(图4)。图4为HCV EDA-ANS3-VAL-44蛋白的纯化结果图。其中M是低分子量蛋白marker，f 4均是纯化出的蛋白。用BCA法测得蛋白浓度为1.55mg/ml。
[0030]SDS-PAGE分离HCV EDA- A NS3-VAL-44重组蛋白，电转移至NC膜上。将膜浸在封闭液中(PBST溶解的5%脱脂奶粉)4°C过夜。用PBST洗膜三次，每次15min。1:1000稀释的抗His标签兔单克隆抗体作为一抗，共同孵育lh，PBST洗膜三次。将膜与1:10000稀释的红外标记的抗兔IgG共孵育lh，PBST洗膜三次，Odyssey红外激光成像系统扫描，结果在相对分子质量约为55 kD处呈现特异性染色条带，表明其为HCV EDA- A NS3-VAL-44蛋白(图5)，其中M是低分子量蛋白marker，I是以BSA作为的对照，2是纯化出的蛋白。
[0031] 4、以HHD-2小鼠作为免疫对象，将原核表达的HCV蛋白疫苗进行免疫以观察其所能引发的免疫效果，具体的免疫方案为:
选用6-8周龄HHD-2小鼠18只，雌雄不拘，分为EDA-ANS3，EDA- ANS3-VAL-44以及PBS皮下给药组，每组各6只。第一次用弗氏完全佐剂，之后用弗氏不完全佐剂。给药时，纯化的蛋白100 Ug /只，poly(1:C) 50 Ug /只以及PBS与弗氏佐剂1:1等体积充分乳化。融合蛋白或PBS与弗氏佐剂充分混匀后皮下注射小鼠，间隔2周加强免疫一次，共免疫3次。第2周、第4周、第6周通过尾静脉取血，分离血清检测抗体产生情况，第6周处死小鼠，检测细胞免疫应答水平(图6)。
[0032]5、免疫后的免疫效果的检测
5.1体液免疫水平检测通过ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体效价。将纯化的HCV ￡04-八吧3-￥41-44蛋白稀释至101^/1111，41:包被过夜；洗涤3次，加入3%BSA 100 U I/孔，37 °C 孵育 I ho PBS 洗涤 3 次后，加 A 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800稀释的免疫小鼠血清，37°C孵育I hrs ;洗涤后实验孔加入1:20000稀释的HRP-抗鼠二抗，37°C孵育I h ;洗涤后OPD显色，室温静置15 min后加入2M H2SO4终止反应，测定各孔的A492值。以正常小鼠血清为阴性对照，试验组/对照组≥2.1时判定为阳性。ELISA滴度表示为最后稀释度的对数。
[0033]各组融合蛋白免疫小鼠的抗体效价均随着免疫时间及次数的增加而逐渐升高。其中融合蛋白EDA-ANS3-VAL-44免疫组抗体效价在首次免疫后第四周达到最高，为1:12800，并在随后的二周内持续保持这一水平，与PBS免疫组相比有统计学意义(P〈0.05)。此外，EDA-ANS3蛋白组最高抗体效价达到了 1:6400 (图7)，与PBS对照组相比具有显著差异。
[0034]5.2细胞免疫水平检测
5.2.1 CTL杀伤性
用LDH (乳酸脱氢酶)细胞杀伤检测试剂盒(具体操作流程按照说明书)检测CTL活性。最后一次免疫后13天处死小鼠，取脾细胞，用HCV EDA-ANS3-
VAL-44蛋白(10 ii g/ml)刺激5天的T淋巴细胞作为效应细胞，用转染了 HCVEDA- A NS3-VAL-44重组质粒的ClR.AAD细胞(是将HMYClR细胞转染了人HLA-A2.1的a I和0 2结构域基因和鼠11-20(1的a 3结构域基因的重组细胞，在CTL杀伤实验中，适合用作评价HLA-A2分子限制性表位的靶细胞)在CTL杀伤实验中做靶细胞。设培养液背景孔、体积校正孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、效应细胞自然释放孔、LDH阳性对照孔以及实验孔(按效靶比分别为50.0:1，25.0:1, 12.5:1以及6.25:1比例将靶细胞、效应细胞加载至96孔细胞培养板中，每孔总体积为100 μl)。
[0035]试验过程如下:按上述将细胞或培养液加入96孔板中，37V,5% CO2孵箱中培养4h，培养结束后，吹打每孔I min，吸取每孔上清50 yl，转移到新的96孔板(每孔加入50yl检测试剂)，室温反应lh。测定每孔0D490 nm的吸光度(A)值，计算每个效/靶比时杀伤百分比。
【权利要求】
1.一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗，其特征在于:包括以下纤连蛋白外部结构域A，ANS3以及VAL-44:其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗在制备针对丙型肝炎病毒的预防性/治疗性疫苗的应用。
3.根据权利要求1所述的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗，在制备抗丙型肝炎病毒的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的体液免疫应答的药物。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的细胞免疫应答的药物。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的药物为刺激分泌IFN-Y的细胞增殖的药物 。
【文档编号】A61P31/14GK103601809SQ201310324897
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】黄小军, 吕欣, 尹文, 雷迎峰, 张瑞国, 杨敬, 姚敏, 贾战生, 兰海云, 张建敏, 曲萍 申请人:中国人民解放军第四军医大学