抗衰老短肽及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种新型抗衰老短肽及制备方法。本发明公开了一种抗衰老短肽命名为G13，由13个氨基酸所组成；同时公开了一种利用大肠杆菌发酵的工艺，可以实现工业化大规模的制备重组G13（简称rG13）。本发明利用多种生物学手段检测，证实rG13具有比同类产品更高的生物学活性，能够刺激细胞大量分泌胶原蛋白，具有抗衰老的能力。本发明所述的抗衰老短肽生物活性显著，生产工艺简单，成本低廉，能够让抗衰老皮肤营养产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。
【专利说明】抗衰老短肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域重组蛋白的设计和制备方法，具体是一种新型抗衰老短肽及其制备方法。
【背景技术】
[0002]人和高等动物的皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成。表皮没有血管，细胞的能量和营养必须由真皮微循环提供。真皮层是皮肤的生命源泉，是一层致密、坚韧且有弹性的组织，主要由纤维成分(胶原蛋白纤维、弹力纤维和网状纤维)、糖蛋白、氨基葡萄糖和玻尿酸等组成。玻尿酸是一种透明的胶状物质，吸水能力可达500-1000倍，是公认的最佳保湿产品。年轻的皮肤，玻尿酸含量高，皮肤光滑、弹性、水嫩、膨胀饱满；皮肤老化时，真皮层变薄，减少了真皮层与表皮层之间物质交换的界面，细胞的正常代谢和有丝分裂作用受到阻碍，皮肤萎缩产生皱纹，因此抗衰老要从补充真皮层营养物质(如胶原蛋白和玻尿酸等)开始。胶原蛋白可以弥补基底膜功能，帮助表皮层与真皮层的结合，能够将水分、养分保送至真皮层。因此，如果能够补充人体皮肤中的胶原蛋白，将能够有效地对抗皮肤衰老的问题。
[0003]棕榈酸五胜肽-3 (Pentapeptide-3)别名五环短肽或五胜月肽，它是由法国著名化妆品公司Sederma公司研发出品的一种人工合成的短肽。它能够有效促进透明质酸、胶原蛋白和弹力纤维增生，减少肌肤细纹，提高肌肤的含水量，增加皮肤厚度，增强肌肤紧致感和光泽度。它是胶原蛋白I (Collagen I)碎片与棕榈酸(Palmitic Acid)结合后得到的对皮肤更具亲和性和亲水、锁水性的物质。研究表明，若将棕榈酸五胜肽-3加入纤维组织母细胞培养皿中，能加强胶原蛋白1、VII (纤维胶原)和纤维黏连蛋白的合成能力，还能促进表皮内的纤维母细胞产生胶原蛋白和玻尿酸等重要成分。可见，棕榈酸五胜肽-3对减轻皮肤老化有重要作用。试管内测试表明，棕榈酸五胜肽-3能迅速激活胶原蛋白IV合成能力达到100%?327%，激活玻尿酸的合成能力达到267%。如今，该短肽已经广泛应用于许多知名品牌的化妆品行列。
[0004]目前，已经有很多国家的知名化妆品品牌的许多系列添加了棕榈酸五肽-3作为抗衰老的营养成分。我国上海和深圳的一些生物科技公司也有该产品销售。但是，目前棕榈酸五胜肽-3的制备方法还都是局限于化学合成，其高额的成本限制了这类产品的广泛使用。因此，为了能使这类短肽类的皮肤营养产品不断走近百姓的日常生活，使得普通人拥有安全、稳定、实用的高品质化妆品，有必要设计研发更加高效的抗衰老短肽，并探索大规模制备抗衰老短肽的技术。
【发明内容】
[0005]本发明为了提高现有抗衰老短肽一棕榈酸五肽-3的生物学活性，同时降低这类美容肽的生产成本，提供了一种新型抗衰老短肽的设计方案，并提供其大规模的制备方法。
[0006]本发明是采用如下技术方案实现的:
一种抗衰老短肽，由13个氨基酸所组成，其氨基酸序列为:Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln，用单字符号表示为 GPKTTKSLEVLFQ。
[0007]上述G13短肽可以通过多种生产工艺进行制备:
1、利用大肠杆菌发酵的工艺，重组表达制备的G13，简称rG13，生产工艺简单，成本低廉，易于推广。
[0008]2、利用化学合成的工艺合成G13，简称sG13，成本较高，但是具有与rG13类似的生物学功能。
[0009]本发明提供上述的抗衰老短肽的制备方法，包括如下步骤:
(1)、大肠杆菌基因工程菌的构建
1.1、设计 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser (用单字符号表示为LEVLFQGPKTTKS)氨基酸序列为基本重复单元L13构建蛋白序列pL13_n，其中η为1-100的任意数值；
1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列nL13, (ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc)n ；
1.3、将核苷酸序列nL13克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；
(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养
2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于LB培养基中35?38°C培养过夜；
2.2、将菌液接种放大培养，35?38°C培养2.5?3小时，加入IPTG进行诱导，15?18°C继续培养18?22小时，此时表达出的蛋白为GST-pL13-n，离心收集菌体；
(3)重组抗衰老短肽rG13的纯化
3.1、用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；
3.2、利用谷胱甘肽亲和柱从上清液中纯化得到抗衰老短肽rG13。
[0010]本发明所述的rG13短肽检测活性如下:
1、抗衰老短肽rG13理论分子量为1447.65Da,无法通过常规的SDS-PAGE进行检测，需要利用质谱方法进行鉴定。用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALD1-T0FAXIMA-CFR Plus (KRATOS Analytical, Shimadzu corporat1n, Japan)在线性模式下进行分析。分析结果如图2所示。
[0011]2、细胞分泌胶原蛋白的过程中，TGF-β会大量表达。因此，TGF-β表达量的增高指示着细胞合成胶原蛋白的增强。以大鼠腱细胞为模型，加入不同浓度的短肽(0.2μ g/ml, 2 μ g/ml, 20 μ g/ml, 200 μ g/ml), 24小时之后收集大鼠腱细胞上清，直接转移到TGF-β的检测试剂盒中进行检测。分析结果如图3所示。
[0012]3、利用标准的MTT法检测抗衰老短肽rG13的细胞毒性。参考标准mtt法的操作方法，加入不同浓度的短肽(0.2 μ g/ml, 2 μ g/ml, 20 μ g/ml, 200 μ g/ml), 24小时之后检测细胞活性。分析结果如图4所示。
[0013]4、免疫组化方法检测抗衰老短肽rG13刺激细胞合成胶原蛋白的效果。以大鼠腱细胞为模型，加入短肽(浓度为20 μ g/ml) 24小时之后，4%多聚甲醛固定，3% BSA封闭，然后用兔抗鼠胶原蛋白的抗体(Novotec, Saint Martin La Garenne, France)进行标记I小时。用荧光显色，然后镜下观察即可。分析结果如图5所示。
[0014]与现有技术相比，本发明制备的抗衰老短肽rG13具有以下特点:
1、本发明所公开的新型抗衰老短肽G13 (GPKTTKSLEVLFQ)，为长期筛选优化的序列，比市场上同类产品效果显著提高。
[0015]2、本发明所公开的新型抗衰老短肽rG13的制备方法，采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，生产成本非常低，而且基因中的序列针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化，进一步提闻了广量。
[0016]3、本发明产品经过多项活性检测，具有目前报道过的最优化的抗衰老效果，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。
[0017]本发明利用多种生物学手段检测，证实抗衰老短肽rG13具有比同类产品更高的生物学活性，能够刺激细胞大量分泌胶原蛋白，具有抗衰老的能力。
[0018]本发明所述的抗衰老短肽生物活性显著,生产工艺简单，成本低廉，能够让抗衰老皮肤营养产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1表示表达载体pGEX-6p-nL13_9的质粒构建图谱。
[0020]图2表示提纯产物中抗衰老短肽rG13的质谱鉴定结果。rG13的理论分子量为1447.65Da,与质谱检测结果完全吻合。
[0021]图3表示抗衰老短肽rG13刺激TGF-β表达的能力的检测结果。与空白对照组、棕榈酸五肽-3 (K5)、合成的G13短肽(sG13)相比，重组表达制备的rG13具有更强的生物学活性。
[0022]图4表示MTT法检测抗衰老短肽rG13的细胞毒性。结果显示，棕榈酸五肽_3(K5)、本发明的基因工程表达的重组短肽rG13、化学合成的G13短肽(sG13)在所示浓度范围内，均未发现显著的细胞毒性。
[0023]图5表示免疫组化方法检测抗衰老短肽rG13刺激细胞合成胶原蛋白的效果。结果显示，rG13可显著刺激大鼠腱细胞产生胶原蛋白，其活性好于棕榈酸五肽-3 (K5)及化学合成的G13短肽(sG13)。
【具体实施方式】
[0024]下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
[0025]一种抗衰老短肽的制备方法，包括如下步骤:
(I)、大肠杆菌基因工程菌的构建
1.1、为了酶切之后获得抗衰老短肽rG13，特别设计氨基酸序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser 为基本重复单兀 L13,构建蛋白序列 pL13_n。
[0026]这种单元的重复数目与最终短肽的收获量成正比关系。通常可以采用1-100个重组单元进行构建，这样构建的目的蛋白序列(LEVLFQGPKTTKS) n简写为pL13_n，其中η为1-100的任意数值；实验证明当η=9时,抗衰老短肽rG13的得率较高。
[0027]本实施例以9个重复单元为例进行说明，9个重复单元的蛋白序列pL13-9为(LEVLFQGPKTTKS)9:
LEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSo
[0028]1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列nL13，并按照大肠杆菌有利的密码子进行优化，获得核苷酸序列nL13-9如SEQ ID N0.1所示:
ctggaggtgctgttccagggcccgaaaaccacaaagagcctggaggtgctgttccaaggtccgaagaccacc
aagagcctggaggtgctgttccaaggcccgaaaaccaccaaaagcctggaggtgctgttccaaggcccgaagaccac
caagagcctggaagtgctgtttcagggtccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccagggccctaaaacca
ccaagagcctggaggttctgtttcagggcccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccaaggcccgaagacc
accaagagcctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagco
[0029]1.3、将核苷酸序列nL13克隆进入表达载体,然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；具体为:
设计引物Pl和P2，
Pl:CGACGGCCAGTGAATTCAGA,
P2:CAGCTATGACCATGCTCGAGTCC,
将引物稀释成50ρπιΟ1/μ 1，引物和核苷酸序列进行PCR步骤，琼脂糖凝胶电泳检测nL13-9条带位于350bp左右，回收目的基因。用3m I和通ο I将基因(上述核苷酸序列)酶切成粘性末端，同样处理pGEX-6p-l载体，加入T4 DNA连接酶，4°C连接12小时，转化大肠杆菌DH5ci，用于质粒的扩增；用氨苄青霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序列分析含有正确的基因序列阅读框架，成功构建pGEX-6p-nL13-9表达载体^fpGEX-6p-nL13-9表达载体，转化BL21菌(筛选得到大肠杆菌基因工程菌)，用于表达蛋白。
[0030](2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养
2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于5ml的LB培养基中35?38°C培养过夜，优选温度为37°C。
[0031]2.2、将菌液按照1:100接种放大培养，35?38°C培养2.5?3小时，加入IPTG进行诱导，15?18°C继续培养18?22小时，优选为37°C培养3小时，加入0.5mM IPTG进行诱导，16°C继续培养20小时；此时表达出的蛋白为GST-pL13-9，离心收集菌体。
[0032](3)重组抗衰老短肽rG13的纯化
3.1、用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用Tris缓冲液20_40ml体积重悬约500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌，在冰水混合物环境下超声破菌(2s超声，5s间歇,全长45min,保护温度44°C ), 12000rpm/min离心20min,收集上清液,此时溶液中即含有大量的GST-pL13-9重组蛋白。
[0033]3.2、用PBS缓冲液清洗谷胱甘肽亲和柱(Glutath1ne Sepharose beads),然后将柱材和破菌上清混合共育，室温或冰上轻摇30min，然后上柱，用含有IM NaCl的PBS溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的GST-pL13-9重组蛋白。
[0034]在柱上加入适量的Presciss1n Protease (简称PPase)蛋白酶,于室温或冰上轻摇2小时，即可将抗衰老短肽rG13从谷胱甘肽亲和柱上释放出来，用PBS溶液洗脱抗衰老短肽rG13，所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。
[0035]上述方法制备的抗衰老短肽rG13由13个氨基酸所组成，其氨基酸序列为=Gly-Pro-Lys-Thr-Thr- Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln,用单字符号表不为GPKTTKSLEVLFQ。利用大肠杆菌发酵的工艺，重组表达制备的rG13，生产工艺简单，成本低廉，易于推广。该rG13被发现具有显著的促进细胞合成胶原蛋白的能力，与现有同类短肽相比，效果更强。
【权利要求】
1.一种抗衰老短肽，其氨基酸序列为=Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln0
2.一种制备权利要求1所述的抗衰老短肽的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)、大肠杆菌基因工程菌的构建 1.1、设计 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser 氨基酸序列为基本重复单元L13构建蛋白序列pL13-n，其中η为1-100的任意数值； 1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列nL13, (ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc)n ； 1.3、将核苷酸序列nL13克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌； (2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养 2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于LB培养基中35?38°C培养过夜； 2.2、将菌液接种放大培养，35?38°C培养2.5?3小时，加入IPTG进行诱导，15?18°C继续培养18?22小时，此时表达出的蛋白为GST-pL13-n，离心收集菌体； (3)重组抗衰老短肽rG13的纯化 3.1、用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液； 3.2、利用谷胱甘肽亲和柱从上清液中纯化得到抗衰老短肽rG13。
3.根据权利要求2所述的抗衰老短肽的制备方法，其特征在于:步骤1.1和1.2中，n=9。
4.根据权利要求3所述的抗衰老短肽的制备方法，其特征在于:步骤1.3具体为，设计引物Pl和P2，
Pl:CGACGGCCAGTGAATTCAGA,
P2: CAGCTATGACCATGCTCGAGTCC, 将引物和核苷酸序列进行PCR步骤，回收目的基因，用I和通ο I将核苷酸序列酶切成粘性末端，同样处理pGEX-6p-l载体，加入T4 DNA连接酶，4°C连接12小时，转化大肠杆菌DH5 α ;用氨苄青霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序列分析含有正确的基因序列阅读框架，成功构建pGEX-6p-nL13-9表达载体；将pGEX-6p-nL13_9表达载体，转化BL21菌。
5.根据权利要求4所述的抗衰老短肽的制备方法，其特征在于:步骤2.2具体为，将菌液按照1: 100接种放大培养，37°C培养3小时，加入0.5mM IPTG进行诱导，16°C继续培养20小时,离心收集菌体。
6.根据权利要求5所述的抗衰老短肽的制备方法，其特征在于:步骤3.1具体为，用PBS缓冲液洗涤混合后的菌体沉淀，用Tris缓冲液重悬菌液沉淀，用溶菌酶配合TritonX-100帮助裂解细菌，在冰水混合物环境下超声破菌，12000rpm/min离心20min，收集上清液，此时溶液中即含有大量的GST-pL13-9重组蛋白； 步骤3.2具体为，用PBS缓冲液清洗谷胱甘肽亲和柱，然后将柱材和破菌上清混合共育，室温或冰上轻摇30min,然后上柱,用含有IM NaCl的PBS溶液洗漆杂蛋白，柱上就剩下了纯的GST-pL13_9重组蛋白；在柱上加入Presciss1n Protease蛋白酶,于室温或冰上轻 摇2小时，即可将抗衰老短肽rG13从谷胱甘肽亲和柱上释放出来。
【文档编号】A61P17/16GK104402975SQ201410755706
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】杨霞 申请人:太原锦波生物医药科技有限公司