一种重组融合蛋白及其用途
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，涉及重组融合蛋白及其用途，具体涉及携带被插入到乙肝核心抗原蛋白颗粒或者截短片段内的乙肝病毒治疗性抗原表位的重组融合蛋白及其用途。该重组融合蛋白包含乙肝病毒HBV多种表位抗原及其他免疫刺激表位抗原和乙肝核心抗原病毒样颗粒或其截短片段制备成嵌合抗原，所述的多种抗原表位可以单表位或者多表位组合的形式插入到乙肝病毒核心抗原HBc或其截短片段中相同或者不同的位点，同时结合不同的佐剂，加强HBV病毒特异性的体液免疫和细胞免疫功能。
【专利说明】一种重组融合蛋白及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属生物医药领域，涉及重组融合蛋白及其用途，具体涉及携带被插入到乙肝核心抗原蛋白颗粒或者截短片段内的乙肝病毒治疗性抗原表位的重组融合蛋白及其用途。
【背景技术】
[0002]据统计，截止2010年全国的乙肝表面抗原流行率为是7.18%，较以前的11%，下降趋势明显，表明目前采用的有关防控手段有效。由于人口基数庞大，中国仍约有9300万例乙肝病毒携带者，其中慢性乙肝患者约2000-3000万。有研究表明，乙肝病毒感染引起的慢性肝炎与肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌密切相关，例如，肝癌患者中90%以上是由乙肝病毒感染引起的。研究表明，乙肝病毒对肝脏损害先表现为肝细胞炎症坏死，尔后发展成肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。每年近30万人死于与乙肝相关的肝硬化和肝癌等，是我国目前最为突出的一个公共卫生问题。因此乙型肝炎病毒感染防治仍是目前中国乃至全世界的科研人员研究的热点。
[0003]目前主流的乙肝治疗方法疗效较好，但各存有缺点，根据最新2010版的《慢性乙型肝炎防治指南》描述，慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗炎和抗氧化、抗纤维化和对症治疗，其中治疗慢性乙肝的关键是抗病毒治疗。目前抗病毒治疗主要采用干扰素和核苷(酸)类似物。干扰素包括普通干扰素和长效干扰素，如派罗欣和佩乐能等；核苷(酸)类似物如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定(素比伏)。所述的干扰素疗程相对固定，HBeAg血清学转换率较高，疗效相对持久，不发生耐药；但不良反应较多，不适用于高血清转氨酶水平(如高于10倍以上正常值上限)的患者，以及失代偿期肝硬化患者[1-7];核苷(酸)类似物口服给药，抑制病毒作用强，不良反应少而轻微，可用于失代偿期肝硬化患者治疗，但疗程相对不固定，HBeAg血清学转换率低，须长期用药，停药后易复发且可能发生病情恶化，甚至出现危及生命的肝功能失代偿，易发生病毒耐药性变异。综上，目前关键的乙肝治疗药物尚无法清除感染者体内的HBV CCC-DNA。
[0004]乙肝治疗性疫苗是近年发展起来的免疫治疗新概念旨在打破机体的免疫耐受，提高机体特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治愈。治疗性乙肝疫苗的应用针对慢性乙肝患者或HBV携带者，可由高纯度和高含量的抗原和免疫佐剂组成增强其免疫原性，并通过不同途径呈递乙肝抗原，打破机体的免疫耐受，有效诱导免疫应答，达到清除乙肝病毒的目的。乙肝治疗性疫苗的安全性、有效性已经获得初步验证，目前全球范围内已经有多个乙肝治疗性疫苗正处于临床试验阶段，我国的某乙肝治疗性蛋白疫苗和DNA疫苗已被SFDA批准，如复旦大学闻玉梅院士和北京生物制品研究所赵铠院士等合作研发的抗原抗体复合物治疗性乙型肝炎疫苗(乙克，简称YIC或YK)，已经进入临床3期，有望成为全球第一个上市的乙肝治疗性疫苗；第三军医大学吴玉章教授领衔的乙肝病毒多肽乙肝治疗性疫苗也已经进入2期临床。这表明乙肝治疗性疫苗的安全性、有效性已经获得初步临床验证，虽然还需要后期长期和大样本人群的检验。
[0005]本申请的发明人在目前乙肝治疗性疫苗的构成及相关研究的基础上，拟提供一种携带乙肝病毒治疗性抗原表位的重组融合蛋白；进一步提供多样表位/HBc组成重组嵌合疫苗。
[0006]与本发明相关的现有技术有:
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【发明内容】
[0007]本发明的目地是基于目前乙肝治疗性疫苗相关研究的背景，提供一种重组融合蛋白及其用途，具体涉及一种携带乙肝病毒治疗性抗原表位的重组融合蛋白及其用，尤其涉及携带被插入到乙肝核心抗原蛋白颗粒或者截短片段内的乙肝病毒治疗性抗原表位的重组融合蛋白及其用途。
[0008]本发明采用乙肝病毒核心颗粒HBc或其截短片段作为HBsAg、HBcAg中多种B细胞刺激表位，CTL表位，及Th细胞刺激表位的疫苗载体，利用其强大的佐剂样作用，有效递呈多种表位，激活高效的针对HBV病毒的机体免疫反应，以期打破病毒慢性感染所产生的免疫耐受状态，达到主要针对乙肝病毒感染免疫治疗的效果及有效的预防长期HBV感染诱发的多种疾病如肝癌等。
[0009]本发明的重组融合蛋白，包含乙肝病毒HBV多种表位抗原及其他免疫刺激表位抗原和乙肝核心抗原病毒样颗粒或其截短片段制备成嵌合抗原，该所述的多种抗原表位可以单表位或者多表位组合的形式插入到乙肝病毒核心抗原HBc或其截短片段中相同或者不同的位点，同时结合不同的佐剂，能加强HBV病毒特异性的体液免疫和细胞免疫功能。
[0010]具体的，本发明的一种重组融合蛋白，由乙肝核心抗原蛋白HBcAg或其合理的截短片段和HBV刺激性表位多肽融合构成，其包括乙肝核心抗原HBcAg或其截短片段，以及由下列的一个或者多个连接而成的肽段:n个B细胞，Th细胞刺激表位和CTL细胞表位(n ^ I) ；i个柔性氨基酸组成的连接短肽序列(i彡O)。
[0011]本发明中，所述的表位可以是以下的一种或几种:B细胞表位是HBV Pre-S2来源的第14-24氨基酸序列(DPRVRGLYFPA)及其变异序列或HBs抗原上的a决定簇(CTKPTDGNCT)及其变异序列；Th细胞刺激表位是破伤风类毒素来源的第830-843氨基酸序列(QYIKANSKFIGITE)及其变异序列或通用Th细胞表位PADRE及其变异序列；CTL细胞表位是乙肝肝炎病毒来源的CTL表位序列，HBV核心抗原上的第18-27氨基酸序列(PLGFFPDH)及其变异序列。
[0012]本发明中，所述的柔性氨基酸组成的连接短肽序列是以下的一种或者几种:AAA，SSS，GGG，GGGS，GGGGSGGGG, GS⑶EGG。
[0013]本发明中，所述的乙肝核心抗原蛋白或其片段是乙肝核心抗原全长蛋白(HBcAg，183AA)，或者氨基端144个氨基酸(HBcAg_N144)及氨基端149个氨基酸(HBcAg_N149);该蛋白片段所需的编码DNA可由化学合成，重叠延伸PCR等众所周知的方式获得。
[0014]本发明中，所述的重组融合蛋白，其表位插入乙肝核心抗原片段或其截短片段的相同或者不同的许可位点，其插入方式分别为:单表位插入，单表位重复插入，单表位经柔性短肽间隔后重复插入，不同单表位组合串联插入，不同单表位组合串联重复插入，不同单表位经柔性短肽间隔后串联插入，或不同单表位经柔性短肽间隔后组合串联重复插入。
[0015]本发明中，所述的乙肝核心抗原或其片段的相同或不同的许可位点，在HBcAg，HBcAg-N144或HBcAg_N149的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg76_81位氨基酸之间的任意η个氨基酸(1<η<6);
所述的重组后的融合蛋白可由众所周知的人工氨基酸合成或者基因表达系统表达获得。
[0016]本发明还是提供了一种以本发明所设计的重组融合蛋白作为主要有效成分的疫苗制品，尤其是乙肝治疗性疫苗制品；本发明还包括医学上可接受的药用佐剂，如铝盐佐剂或者细胞因子如GM-CSF作为免疫佐剂。
[0017]本发明提供编码上述重组融合蛋白氨基酸序列的DNA序列，由于基因的简并性，编码相同肽段的DNA序列不是唯一的，但均应属于本发明的保护范围。
[0018]本发明的又一目的是提供制备乙肝核心抗原HBc或其截短片段-多肽表位重组融合蛋白的方法。
[0019]制备该重组融合蛋白的方法包括以下几个部分:首先通过化学合成或重叠延伸PCR的方法可获得乙肝核心抗原全长蛋白(HBcAg，183AA)，氨基端144个氨基酸(HBcAg-N144)及氨基端149个氨基酸(HBcAg_N149)所对应的基因序列，再通过同样的方法将HBsAg，HBcAg中的B细胞表位，CTL细胞表位，和Th刺激表位或其变异序列，分别以如下的方式:单表位插入，单表位重复插入，单表位经柔性连接短肽间隔后重复插入，不同单表位组合串联插入，不同单表位组合串联重复插入，不同单表位经柔性连接短肽间隔后组合串联插入，不同单表位经柔性连接短肽间隔后组合串联重复插入HBcAg的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg76-81位氨基酸之间的任意η个氨基酸(I ^ n ^ 6);或插入截短的HBcAg-N144，HBcAg-N149片段的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg76_81位氨基酸之间的任意η个氨基酸(I n ^ 6),成为一个人工融合基因，并将该基因在表达载体系统中表达纯化，得到乙肝核心抗原蛋白HBc或截短片段-治疗性多肽表位重组融合蛋白。该重组融合抗原纯化后与其他佐剂如GM-CSF等制备成完整的疫苗，可制备成溶液，悬液，气溶胶，乳液，固体或脱水物形式，例如作为冻干粉在无菌管形瓶中保存。
[0020]本发明在HBV病毒B细胞刺激表位，CTL表位及通过Th细胞刺激表位或破伤风类毒素刺激表位的单个表位或组合在一起的多个表位插入到乙肝核心抗原蛋白或其片段的不同位点，制成了能够对HBV病毒特异性细胞免疫的重组融合蛋白，建立了抗原表达方法，并初步评价免疫原性和保护性，为现有乙肝疫苗的适用和发展表位疫苗等新型疫苗提供依据。
[0021]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是HBC-N149片段蛋白发酵及纯化产物的SDS-PAGE和dot_blot分析，
其中，Lanel-2 细胞破碎液；lane3 蛋白 marker (7, 14, 28, 40, 65, 90Kd)；
Lane4:纯化的融合蛋白。
[0023]图2显示重组融合蛋白的颗粒直径(30nm)。
[0024]图3是抗preS2_B表位及HBc抗体滴度检测，其中显示融合蛋白疫苗免疫2次后一周，用ELISA方法检测抗preS2-B表位及HBc抗体滴度，结果表明，与生理盐水对照组相t匕，疫苗组能激发高强度的体液免疫效果。
[0025]图4 IL4和IFNy的检测，
其中显示融合蛋白疫苗免疫3次后一周，采集脾脏，用流式细胞仪检测IL4和IFNy阳性的细胞丰度，结果表明，经HBcAg-N149蛋白及重组融合蛋白HBcAg-N149/preS2免疫3次后，与生理盐水组相比，细胞免疫被明显激活。
【具体实施方式】
[0026]实施例1以HBcAg_N149片段为例制备乙肝核心抗原蛋白载体或其截短片段编码乙肝核心抗原HBcAg-N149基因片段可从乙肝病毒颗粒(HBV)经PCR方法获得，截取1-149个氨基酸残基，5’和3’端分别加上和PWI的酶切位点。该HBcAg_N149基因片段通过和RsiI的酶切，连接导入大肠杆菌表达质粒Pcold IV，重组大肠杆菌表达质粒导入大肠杆菌表达宿主菌JM109。将鉴定阳性的重组菌落接入5 mL LB培养液中，37°〇振荡培养至培养液的4_达0.4-0.6。各取2 mL培养菌液加入200 mL氨苄青霉素的LB培养液中，振荡培养3 h，然后加入IPTG至终浓度为I mmol/L，低温培养16 h,诱导蛋白表达。收集细菌用裂解缓冲液和超声细胞粉碎机裂解细菌，分别收集上清和沉淀。将沉淀(包涵体)充分溶解于8 mol/L尿素中，室温16 h,收集上清，在含复性液的透析袋中透析48 h,收集上清即为复性后的表达蛋白，经离子交换柱和分子量，纯化后经SDS-PAGE鉴定为17kD左右，用dot-blot方法，使用HBc抗体检测，表达和纯化的蛋白呈阳性反应结果如图1所示。
[0027]实施例2 将B细胞表位插入HBcAg_N149合理位点组成融合蛋白为例制备携带HBV治疗性多肽表位的HBcAg或截短片段重组融合蛋白
将编码HBV Pre-S2来源的第14-24氨基酸序列(DPRVRGLYFPA)的基因序列用重叠PCR的方式插入HBcAg-N149片段的78-79位氨基酸之间，5’和3’端分别加上和PWI的酶切位点。该HBcAg-N149基因片段通过^amHl和PWI的酶切，连接导入大肠杆菌表达质粒Pcold IV，重组大肠杆菌表达质粒导入大肠杆菌表达宿主菌JM109。将鉴定阳性的重组菌落接入5 mL LB培养液中，37°C振荡培养至培养液的A_达0.4-0.6。各取2 mL培养菌液加入200 mL氨苄青霉素的LB培养液中，振荡培养3 h,然后加入IPTG至终浓度为I mmol/L,低温培养16 h,诱导蛋白表达。收集细菌用裂解缓冲液和超声细胞粉碎机裂解细菌，分别收集上清和沉淀。将沉淀(包涵体)充分溶解于8 mol/L尿素中，室温16 h,收集上清，在含复性液的透析袋中透析48 h,收集上清即为复性后的表达蛋白。将纯化后的重组融合蛋白经电子显微镜观察，发现其颗粒与天然的HBcAg颗粒大小类似，为30nm左右(如图2所示)。
[0028]实施例3
以重组HBcAg-N149片段与重组融合蛋白HBcAg-N149/preS2为例说明疫苗诱导HBV特异性免疫应答实验
设立3个实验组，分别为生理盐水组，HBcAg-N149组，重组融合蛋白HBcAg_N149/preS2组；在6个雌性的BALB/c小鼠中试验(每组)，每小鼠在0，21，42天皮下注射0.1-1OOPg融合蛋白和1Mg招盐佐剂。
[0029]在第二次免疫后一周，检测抗preS2_B表位的抗体，结果如图3所示，有超过15的抗preS2-B表位的抗体滴度，及超过13滴度的针对HBc的抗体滴度，结果显示有剂量依赖关系；HBcAg-N149不能诱导抗preS2-B表位的抗体；在第三次免疫后一周，检测脾脏中细胞免疫反应(IL4和IFNy )，结果如图4所示，3次免疫以后，结果显示，HBcAg-N149/preS2融合蛋白疫苗能诱导大量的IL4及IFNy细胞因子分泌，引发有效的细胞免疫效应。
【权利要求】
1.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白包括乙肝核心抗原HBcAg或其截短片段，以及由下列的一个或者多个连接而成的肽段:n个B细胞，Th细胞刺激表位和CTL细胞表位(n ^ I) ；i个柔性氨基酸组成的连接短肽序列(i彡O)。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于:所述的B细胞表位是HBVPre-S2来源的第14-24氨基酸序列DPRVRGLYFPA及其变异序列或HBs抗原上的a决定簇CTKPTDGNCT及其变异序列；Th细胞刺激表位是破伤风类毒素来源的第830-843氨基酸序列QYIKANSKFIGITE及其变异序列或通用Th细胞表位PADRE及其变异序列；CTL细胞表位是HBV核心抗原(HBcAg)上的第18-27氨基酸序列PLGFFPDH及其变异序列。
3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于:所述的柔性连接短肽序列是AAA, SSS, GGG, GGGS, GGGGSGGGG, GS⑶EGG 中的一种或者几种。
4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于:所述的乙肝核心抗原蛋白或其片段是乙肝核心抗原全长蛋白(HBcAg，183AA)，或者氨基端144个氨基酸(HBcAg_N144)及氨基端149个氨基酸(HBcAg-N149)。
5.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于:其表位插入乙肝核心抗原片段或其截短片段的相同或者不同的许可位点，其插入方式为:单表位插入，单表位重复插入，单表位经柔性短肽间隔后重复插入，不同单表位组合串联插入，不同单表位组合串联重复插入，不同单表位经柔性短肽间隔后串联插入，或不同单表位经柔性短肽间隔后组合串联重复插入。
6.根据权利要求5所述的重组融合蛋白，其特征在于:所述的乙肝核心抗原或其片段的相同或不同的许可位点在HBcAg，HBcAg-Nl44或HBcAg_N149的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg76-81位氨基酸之间的任意η个氨基酸(I < η < 6)。
7.—种乙肝治疗性疫苗制品，其特征在于，以权利要求1所述的重组融合蛋白作为有效成分。
8.根据权利要求7所述的乙肝治疗性疫苗制品，其特征在于:所述疫苗中还包括医学上可接受的药用佐剂。
9.根据权利要求7所述的乙肝治疗性疫苗制品，其特征在于:其给药途径是:皮下注射给药或粘膜给药方式，其制剂是注射液或气雾剂。
【文档编号】A61K39/29GK104341506SQ201310324703
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】史训龙, 周珮, 鞠佃文, 周伟, 黄海, 冯美卿, 朱海燕, 叶丽 申请人:复旦大学