一种补充人体必需氨基酸的口服重组营养多肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及必需氨基酸构成多肽及其重组芽孢表面展示的制备方法及产品，具体 涉及一种补充人体必需氨基酸的口服重组营养多肽的制备方法，属于重组融合蛋白药物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 氨基酸（Aminoacid)是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构 形态，参与蛋白质的催化、运输、运动、防御与保护信息的传递等生理生化过程。自然界中 组成蛋白质的氨基酸主要是20种，其中人体不能合成或合成速度较慢满足不了人体新 陈代谢需要的氨基酸称为必需氨基酸。必需氨基酸通常有8种，即异亮氨酸、亮氨酸、赖 氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸，一般由食物蛋白质供给。如果人体缺 乏任何一种必需氨基酸，就可导致生理功能异常，影响抗体代谢的正常进行，从而使机体 的免疫功能下降而导致疾病。必需氨基酸摄入不足也会引起胰岛素合成的减少，这样就 容易引起血糖的升高导致糖尿病的发生发展（MiyakeT,AbeM,FurukawaS,etal. Long-termbranched-chainaminoacidsupplementationimprovesglucosetolerance inpatientswithnonalcoholicsteatohepatitis-relatedcirrhosis.InternMed, 2012，51(16): 2151-2155.)。人体随着年龄的变化其蛋白质的合成和降解也在发生变化， 一般认为老年人体内的蛋白质分解较多而合成较慢，所以老年人对于青壮年来说需要合成 蛋白质的原料更多，特别是对甲硫氨酸和赖氨酸的需求（TatpatiLL,IrvingBA,TomA, etal.Theeffectofbranchedchainaminoacidsonskeletalmusclemitochondrial functioninyoungandelderlyadults.JClinEndorcrinolMetab, 2010， 95(2): 894-902)。近年研究报告，老年人与中青年人给予相同营养条件，但老年人其血浆氨基酸 (缬、亮、酪、赖、蛋、丝、丙氨酸）含量减低，特别支链氨基酸BCAA(缬、亮、异亮氨酸）显示不 足。1998年美国"发现"号航天飞机在太空的人体试验证明了必需氨基酸的摄入能够提高 机体的抵抗力和延缓衰老，后续的临床试验也说明了必需氨基酸的补充对于老年人来说相 当必要。运动营养学研究也表明BCAA的补充能够减慢能源物质的消耗，延缓疲劳的发生， 促进疲劳的恢复（KimDH,KimSH,JeongWS,etal·EffectofBCAAintakeduring enduranceexercisesonfatiguesubstances,muscledamagesubstance,andenergy metabolismsubstances.JExercNutritionBiochem, 2013, 17(4): 169-180·)。目前 市场上有许多相关的复合氨基酸口服液，但是这类产品价格昂贵，且支链氨基酸BCAA所含 比例不高，容易受到胃肠道极端环境对氨基酸结构的影响和破坏，降低吸收效率。目前已有 通过基因工程的方法用大肠杆菌发酵生产重组各种营养多肽，但要实现口服来消化多肽来 补充必需氨基酸，提高人体运动效率和减少疲劳仍有许多的缺点和不足，因为大肠杆菌含 有许多内毒素，这样对产品纯度的要求极高，任何微量的杂蛋白都可能造成严重的免疫反 应。这使得发酵法生产重组营养多肽的分离纯化方法和步骤复杂，生产成本较高。
[0003] 枯草芽孢杆菌为环境友好型细菌，对弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害细菌有很 强的抑制作用，营养缺乏时能形成处于代谢休眠状态的芽孢，在适宜条件下芽孢又能萌发 成具有繁殖能力的营养细胞，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶、糖化酶等促进 消化吸收的物质。芽孢容易培养，比重大易分离、不需要复杂的分离纯化操作。芽孢是生物 界中抗逆性最强的生命体，其稳定性好，能耐氧化，耐高温，能长期耐60°C高温，在120Γ~ 140°C还能生存几小时，并且在抗化学药物和抗辐射等方面也十分突出，可在恶劣环境中存 活几年至几十年。芽孢在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，顺利通过 动物消化道直达大小肠，可作为极端环境(如胃肠道）下异源蛋白或生物活性分子的载体 (OggioniMR,CiabattiniA,CupponeAM,andPozziG. 2003.Bacillussporesfor vaccinedelivery.Vaccine. 31: 96-101)。枯草芽孢杆菌以孢子状态进入消化道后，迅 速由休眠状态复活，在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，消耗掉肠道内大量氧气，并能产 生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌(大肠杆 菌、沙门氏杆菌）的生长，因而能预防腹泻、下痢等肠胃道疾病，增强机体的免疫力和体质水 平。目前市场上已经有口服枯草芽孢杆菌活菌胶囊产品，北京紫竹药业有限公司，国药准字 S20030018 (http://www. 777aaa.com/html/yao/200791823 402711963569029.htm)，表明 枯草芽孢杆菌芽孢可以通过人口服使用而产生药效性。
[0004] 本发明的目的在于根据人体胃肠道的消化特征，以益生菌枯草芽孢杆菌芽孢衣壳 蛋白为载体，通过芽孢展示技术将带有肠激酶标签Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的营养多肽展示 在芽孢表面，使多肽获得快速大量表达具有良好抗逆性的同时能够在人体肠道进行增殖和 自由消化吸收，适用于快速大量制备具有补充必需氨基酸功效的重组营养多肽的口服保健 品。该产品结合了枯草芽孢杆菌的抗逆性特征和人体胃肠道的消化特点，增加了肠激酶位 点，开发出能够在人体口服进行自由消化吸收的营养多肽保健品，同时，能进行大规模的工 业生产，迄今尚未见类似的报道和发明专利。
【发明内容】
[0005] 为了有效获得补充人体必需氨基酸来提高人体营养和运动效率，本发明提供了一 种表面展示富含BCAA营养多肽重组芽孢的制备方法和产品。本发明以枯草芽孢杆菌芽孢 衣壳蛋白CotC为载体，通过芽孢表面展示技术将带有肠激酶标签Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的 营养多肽展示在枯草芽孢杆菌的芽孢表面，可用于动物直接口服，成为一种新型提高运动 效率富含BCAA的营养多肽，其在安全性、耐受性、药效学以及药代动力学等方面与复合氨 基酸具有类似的功效。相对于其它氨基酸口服液产品，本发明表面展示营养多肽的制备方 法主要用于机体为提高运动效率服用，同时具有工业化生产特点，具有更广泛的应用价值。 这种产品的发明克服了当前BCAA来源于化学合成的限制，同时也克服了大肠杆菌发酵生 产的营养多肽分离纯化过程复杂的缺点，在保健品领域具有良好的应用前景。
[0006] 本发明所采用的技术方案为：一种口服重组营养多肽的制备方法，利用枯草芽孢 杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotC为分子载体，与带有肠激酶标签的营养多肽基因np重组，构建 融合表达的整合型重组质粒PJS700-NP，并转化枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌重组菌株 SaciWys 168 /pJS700-NP，诱导重组菌株产生重组芽孢，在重组芽孢表面展示 有重组营养多肽，所述重组芽孢可通过口服补充人体必需氨基酸。
[0007] 一种重组芽孢，是由枯草芽孢杆菌重组菌株168 /pJS700-NP 诱导形成的重组芽孢，其表面展示有带有肠激酶标签的融合蛋白CotC-NP。本发明的具体操 作是： (1) 设计一段DNA片段（SEQIDNO. 1)，包含营养多肽基因片段，命名为np，所述营养多 肽基因片段包括人体必需八种氨基酸的(赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异 亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸）基因片段，进一步的，所述营养多肽基因np包括BCAA(支链氨基 酸）基因片段； (2) 通过PCR的方法从公司合成DNA片段(上海生工）中扩增获得营养多肽基因np， 将获得的基因插入到载体PMD18-T中并转化大肠杆菌DH5a保存；克隆的重组质粒命名为 PMD18-T-NP，重组子菌株命名为DH5a/pMD18-T-NP; (3