多肽、支架组合物、软骨组织修复用组合物、软骨细胞培养用组合物及糖胺聚糖产生促进 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽、支架组合物、软骨组织修复用组合物、软骨细胞培养用组合物及 糖胺聚糖产生促进用组合物。
【背景技术】
[0002] 目前，谋求陷入功能障碍或功能衰竭的生物体组织或脏器再生的再生医疗的实用 化得到发展。再生医疗是使用细胞、支架及生长因子这三种因子重新构出仅通过生物体所 具有的自然治愈能力无法恢复的生物体组织并使其具有与原来的组织相同的形态或功能 的新的医疗技术。
[0003] 在再生医疗的领域中，为了补充由细胞进行的组织的修复或再生等，有时利用生 物亲和性高的胶原或明胶。特别是有时在骨或皮肤等三维结构的组织的再生中使用胶原或 明胶，为了进行更良好的组织再生，对胶原或明胶进行了各种改良。
[0004] 已知软骨、例如关节软骨是由极少（2%左右）的软骨细胞和细胞外基质构成的组 织，该细胞外基质由约70%的水分、约20%的胶原、约10%的蛋白多糖构成。细胞外基质 中蛋白多糖是由约95%的被称为糖胺聚糖（GAG)的多糖类和约5%的蛋白质构成的糖蛋 白。在这样的软骨中，软骨细胞被自身产生的胶原或蛋白多糖将周围包围而得到支撑。特 别是糖胺聚糖具有在软骨基质内保持水分的作用，被认为是参与软骨的退化抑制或修复的 物质。因此，作为软骨细胞的支架材料，研宄了基于软骨细胞的基质产生变得良好的支架材 料的开发。
[0005] 作为软骨细胞的支架材料，以往使用天然II型胶原。
[0006] 另外，在日本特表2007-528699号公报中，公开了涂敷有强化了细胞结合性的RGD 富集明胶样蛋白的细胞支撑物，并记载了这样的细胞支撑物可以在例如皮肤移植、创伤治 愈或者增强骨或软骨的生长（再生）时使用。
[0007] 在国际公开第2008/133196号中，公开了具有作为细胞粘附信号的RGD序列的基 因重组明胶，并记载了能够作为细胞粘附性基质使用。另外，在国际公开第2008/133196号 中，记载了在细胞治疗的情况下，通常优选成为细胞的支架的细胞粘附性的基质材料，但记 载了在软骨再生中，优选可耐受强度的基质。
【发明内容】
[0008] 发明所要解决的问题
[0009] 然而，如上述那样，细胞外基质中GAG是大力参与软骨细胞代谢的基质物质，但就 目前使用的天然II型胶原而言，在细胞外基质的产生促进的方面并不充分。另外，关于促进 基于软骨细胞的基质产生的支架材料，以往是未知的。此外，关于从细胞外基质产生的观点 出发可促进软骨组织修复的软骨组织修复用组合物及软骨细胞培养用组合物、以及可良好 地促进细胞外基质中糖胺聚糖在细胞中的产生的组合物，也尚未得到提供。
[0010] 因此，本发明的课题在于提供软骨细胞的细胞外基质产生促进优异的支架组合 物、软骨组织修复用组合物、软骨细胞培养用组合物及糖胺聚糖产生促进用组合物以及用 于它们的材料。
[0011] 用于解决问题的方法
[0012] 本发明如下。
[0013] [1] -种多肽，其具有每10kDa分子量的RGD序列的含有数为0.30个以上、每 10kDa分子量的GFPGER序列的含有数为0. 15个以上、每10kDa分子量的GVMGFP序列的含 有数低于〇. 30个的氨基酸序列。
[0014] [2]根据[1]所述的多肽，其总长的氨基酸残基数为300~1400。
[0015] [3]根据[1]或[2]所述的多肽，其与天然人II型胶原的氨基酸序列的同源性达到 85%以上。
[0016] [4]根据[1]~[3]中任一项所述的多肽，其分子量为30kDa~80kDa。
[0017] [5]根据[1]~[4]中任一项所述的多肽，其等电点（pi)为6.0以下。
[0018] [6]根据[1]~[5]中任一项所述的多肽，其为重组肽。
[0019][7] -种多肽，其为下述（A)、⑶或（C)的多肽：
[0020] (A)具有序列号1~3所示的氨基酸序列的多肽，
[0021] (B)具有在序列号1~3所示的氨基酸序列中缺失、替换或附加了 1个或多个氨基 酸的氨基酸序列，且具有糖胺聚糖产生促进能力的多肽，
[0022] (C)具有与序列号1~3所示的氨基酸序列的序列同源性为80%以上的氨基酸序 列，且具有GAG产生促进能力的多肽。
[0023] [8] -种多肽，其具有与序列号1~3所示的氨基酸序列的序列同源性为90%以 上的氨基酸序列，且具有糖胺聚糖产生促进能力。
[0024] [9] 一种多肽，其具有与序列号1~3所示的氨基酸序列的序列同源性为95%以 上的氨基酸序列，且具有糖胺聚糖产生促进能力。
[0025][10]-种支架组合物，其包含[1]~[9]中任一项所述的多肽。
[0026] [11] 一种软骨组织修复用组合物，其包含[1]~[9]中任一项所述的多肽。
[0027] [12] -种软骨细胞培养用组合物，其包含[1]~[9]中任一项所述的多肽。
[0028] [13] -种糖胺聚糖产生促进用组合物，其包含[1]~[9]中任一项所述的多肽。
[0029] [14] [1]~[9]中任一项所述的多肽在支架组合物的制造中的用途。
[0030] [15] [1]~[9]中任一项所述的多肽在软骨组织修复用组合物的制造中的用途。
[0031] [16] [1]~[9]中任一项所述的多肽在软骨细胞培养用组合物的制造中的用途。
[0032] [17] [1]~[9]中任一项所述的多肽在糖胺聚糖产生促进用组合物的制造中的用 途。
[0033] [18]-种软骨的损伤的修复或再生方法，其包含将[11]所述的软骨组织修复用 组合物投与给软骨的损伤部位。
[0034] 发明效果
[0035] 根据本发明，能够提供软骨细胞的细胞外基质产生促进优异的支架组合物、软骨 组织修复用组合物、软骨细胞培养用组合物及糖胺聚糖产生促进用组合物以及用于它们的 材料。
【附图说明】
[0036] 图1是表示基于实施例及比较例的各多肽的GAG产生促进能力评价的结果的图 表。
【具体实施方式】
[0037] 本发明中的多肽为具有每10kDa分子量的RGD序列的含有数为0.30个以上、每 10kDa分子量的GFPGER序列的含有数为0. 15个以上、每10kDa分子量的GVMGFP序列的含 有数低于〇. 30个的氨基酸序列的多肽。
[0038] 本发明中，通过具有上述构成，在软骨细胞与本发明的多肽接触时可促进基于软 骨细胞的细胞外基质、特别是糖胺聚糖（以下，有时称为GAG。）的产生。
[0039] 即，例如为了比天然II型胶原更加促进GAG的产生，RGD序列及GFPGER序列需要 分别存在上述规定的含有数以上，另一方面，GVMGFP序列在多肽整体中需要每10kDa分子 量为〇或不超过〇. 30个。另外，本发明中，通过满足RGD序列、GFPGER序列及GVMGFP序列 的含有数的上述的关系，可促进基于软骨细胞的GAG产生。此外推测，在与本发明的多肽接 触后的软骨细胞的周边存在丰富的GAG，可得到软骨细胞的优异的增殖或生长。但是，本发 明并不限于这些理论。
[0040] 以下，有时将本发明的多肽称为"特定多肽"。
[0041] 以下，对本发明进行说明。
[0042] 本说明书中"工序"这一用语不仅包括独立的工序，在无法与其他工序明确区别的 情况下只要可达成该工序所期望的目的，也就包含在本用语中。
[0043] 另外，本说明书中使用"~"表示的数值范围表示包含"~"的前后记载的数值分 别作为最小值及最大值的范围。
[0044] 此外，本说明书中，关于组合物中各成分的量，在组合物中存在多种属于各成分的 物质的情况下，只要没有特别说明，是指组合物中存在的该多种物质的合计量。
[0045] 本发明中，有时将氨基酸序列中的氨基酸残基用本技术领域中公知的单字母表 述（例如，在甘氨酸残基的情况下为"G"）或三字母表述（例如，在甘氨酸残基的情况下为 "Gly"）来表示。
[0046] 本发明中，关于多肽的氨基酸序列的" ％ "只要没有特别说明，则以氨基酸（或亚 氨基酸）残基的个数为基准。
[0047] 本说明书中，对氨基酸序列的特定的氨基酸残基使用的"对应的氨基酸残基"等表 述意味着表示，将进行对比的2个以上的氨基酸序列通过该技术领域中公知的方法在考虑 到插入、缺失、及替换的基础上，按照相同的氨基酸残基成为最多的方式排列（对齐）时，与 作为基准的氨基酸序列中的特定的氨基酸残基的位置一致的另一氨基酸序列中的氨基酸 残基。
[0048] 本发明中，关于对比的2种多肽的氨基酸序列的"同源性"是指通过以下的式子计 算得到的值。另外，多个多肽的对比（对齐）按照相同的氨基酸残基的数目成为最多的方 式根据常规方法来进行。
[0049] 另外，作为关于重组的多肽的同源性的判断，按照同源性成为最高的方式，将所对 比的2种多肽分别分成达到10个氨基酸残基以上的任意的片段，使来自一个多肽的片段与 来自所对比的另一个多肽的片段之间对应，在对应了的片段间将氨基酸序列进行比较、综 合，求出同源性。另外，关于包含多个重复序列（10个氨基酸残基以上的序列）的多肽，将 第2个以上的重复的部分除去，求出对应的部分的同源性（％ )。
[0050] 同源性（％)=[(相同的氨基酸残基的数目V(对齐长度）]x 100
[0051] [特定多肽]
[0052] 本发明的特定多肽具有每10kDa分子量的RGD序列的含有数为0. 30个以上、每 10kDa分子量的GFPGER序列的含有数为0. 15个以上、每10kDa分子量的GVMGFP序列的含 有数低