专利名称：用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途，是从东亚钳 蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离得到一种新的多肽——蝎毒增殖肽(Scorpion Venompro 1 iferative Peptide from Buthus martensii Karsch, BmKpp),该多妝具有促进 造血细胞(正常/辐射后)增殖的作用。属于生物技术领域。
背景技术：
全世界蝎目分6科，70属，约800余种，中国境内主要为东亚钳蝎，后者在历史上一 直作为我国传统、名贵中药之一的“全蝎”而享誉海内外。蝎毒为蝎尾节毒囊中排泌出来的 一种有毒分泌物，是全蝎治疗疾病的主要有效部位，其对肿瘤、疼痛、心血管疾病的疗效较 全蝎强数倍。蝎毒以毒攻毒的药理作用是建立在全蝎及蝎尾千百年来大量临床应用的基础 之上，具有鲜明的民族特色。蝎毒是一个巨大的生物资源宝库，其中大部分是具有药理学活性的多肽类。目前， 蝎毒中已分离出的蝎毒素大约有30种左右，主要是由35 70个氨基酸所组成的短肽，分 子量约在4000 9000D之间，pH变化对蝎毒素的毒性影响不大，在加热至100°C并持续 15 30min后，毒性依然较强。国外在蝎毒方面的研究始于十九世纪末，自上个世纪九十年 代以来，蝎毒作为研究离子通道的工具及制作抗毒血清的原料而成为国际上研究的重点。 从LQS蝎毒中分离出的氯毒素及charybdotoxin，对恶性神经胶质瘤细胞膜上的离子通道 有特异的亲和作用，细胞的恶性度越高，氯毒素对它们的亲和作用越强。氯毒素与同位素结 合后，其对胶质瘤的定向杀伤作用更为显著。此外，蝎毒素能够阻滞细胞膜的K+通道，同时 导致Ca2+的内流减少，使肿瘤细胞的生长延缓。我国在蝎毒方面的研究虽然起步晚，但在中医临床验证及理论体系(攻毒散结、 通经活络、平肝熄风)的指导下，在抗肿瘤、抗痛、抗癫痫、抗凝、抗肝炎、抗风湿等领域均取 得了丰硕的成果。目前，国内外对蝎毒及其毒素(单一成分的纯品)抑制细胞生长的细胞生物学效 应及作用机理有较多的研究，而对于其促进细胞增殖和防护细胞应激性损伤(辐射等)等 方面尚无类似报道。在以往的研究中，我们利用凝胶过滤层析技术，从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch, BMK)蝎毒中分离得到了蝎毒多肽(Scorpion Venom Polyp印tide，SVP)，并利用离 子交换层析技术从SVP中进一步分离得到了有效组分——SVPIV和SVP V。实验表明，SVPIV 和SVP V对辐射后小鼠的骨髓有核细胞数、骨髓粒单系祖细胞集落形成单位(CFU-GM)数 量、骨髓基质细胞集落数、脾结节数、骨髓细胞的增殖指数等均有升高的促进作用。其中， SVP IV促进造血细胞增殖的作用明显优于SVP V，而且前者应用30分钟后，还可促进小鼠 骨髓细胞磷酸化STAT3蛋白表达水平明显升高(参考文献1-3)。上述的研究结果已被国 外的研究者引用Salman (参考文献4)。Salman发现，全身辐射后的雄性豚鼠注射了从蝎毒 (Buthus occitanus) ^^iWMXW^i 13"f (bradykinin potentiating factor, BPF)
3后，血清总蛋白和白蛋白的水平均提高，认为从蝎毒中分离的BPF能够促进生长因子和/或 生长激素的分泌，进而增加肝脏蛋白质的合成，减轻辐射损伤作用。说明蝎毒多肽在促进细 胞增殖和防护细胞应激性损伤(辐射等)的药物开发方面具有重要的意义。在近期实验中，申请者观察到从SVP IV中进一步纯化出的单一毒素纯品——蝎 毒增殖妝(Scorpion Venom proliferative Peptide from Buthus martensii Karsch, BmKpp)，在促进造血细胞(正常/辐射)增殖方面较SVP IV具有更显著的生物学活性。
发明内容
本发明的目的之一，是为了提供一种用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，该用于促进 细胞增殖的蝎毒多肽是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离一种新的蛋白 质。本发明的目的之二，是为了提供一种用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法。本发明的目的之三，是为了提供一种用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的药用用途。本发明的目的之一可以通过采取如下技术方案达到用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，其特征是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离、纯化而成，所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N端30个氨基酸残基 的序列如序列表SEQ ID Na 1所示，其分子量为7212. 32830Da。本发明的目的之二可以通过采取如下技术方案达到用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于它包括以下步骤1)采集东亚钳蝎蝎毒，利用电刺激法从成年东亚钳蝎体内提取新鲜毒液，真空冷 冻干燥成凝胶，备用；2) SVP IV分离，首先进行凝胶过滤采用分子筛层析凝胶S印hadex G-50Medium对 蝎毒粗毒溶液进行分离，收集峰II冻干，备用；然后进行离子交换采用CM Sepharose FF 填料，通过离子凝胶柱对峰II进行进一步纯化，用洗脱液为ph = 6. 4的磷酸盐缓冲液进行 梯度洗脱，收集SVP IV，用VIVAFLOW 50切向超滤器脱盐，冻干，备用；3) BmKpp纯化，首先进行离子交换采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱 对第2)步形成的SVP IV进行进一步纯化，用洗脱液为ph = 6. 4的磷酸盐缓冲液进行梯度 洗脱，收集目标峰，用VIVAFL0W 50切向超滤器脱盐，冻干，备用；然后用HPLC分析得知，由 离子交换所得的目标峰——BmKpp的纯度达95%以上。4)测定BmKpp分子量及其氨基酸序列，用质谱分析法测定BmKpp的精确分子量为 7212. 32830Da，用埃德曼降解法(Edman degradation)测定BmKpp N端30个氨基酸残基的 序列如序列表SEQ ID Na 1所示。经BLASTp比对的结果表明，BmKpp与已知蛋白的相似性均较低(< 35% )，说明 BmKpp是一种新的多肽。本发明的目的之二还可以通过采取如下技术方案达到实现本发明的目的之二的一种实施方案是前述第2)步中所用分子筛层析的层 析柱规格为50cmX 5. 5cm,所用离子凝胶柱规格为IOOcmX 5. 5cm,所述洗脱液由A液和B液 组成，其中A液为0. 05M磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的分子式Na2HP04/NaH2P04，B液为 含0. 3M的A液。
实现本发明的目的之二的一种实施方案是前述第3)步中所用离子凝胶柱规格 为50cmX 5. 5cm,所述洗脱液由A液和B液组成，其中A液为0. 05M磷酸盐缓冲液，该磷酸盐 缓冲液的分子式为Na2HP04/NaH2P04，B液为含0. 3M的A液。实现本发明的目的之二的一种实施方案是前述第3)步所用HPLC分析过程中，采 用流动相A液为0. 1 % TFA/H20, B液为70%乙腈+0. 1 % TFA ；洗脱程序为0 60min，B液 浓度由0 100，洗脱速度为0. 5ml/min。实现本发明的目的之二的一种实施方案是前述第4)步所用质谱分析法，为 Bruker公司的9. 4T混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS法。本发明的目的之三可以通过采取如下技术方案达到用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的药用用途，其特征在于1)促进正常造血细胞增殖作用；2)促进辐射后骨髓造血细胞增殖。本发明具有如下突出的有益效果本发明所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽BmKpp是来源于东亚钳蝎蝎毒的一种 新的多肽，并具有促进造血细胞(正常/辐射后)增殖的作用。所述用于促进细胞增殖的 蝎毒多肽BmKpp成分单一、精确分子量及N端30个氨基酸残基清楚，其促细胞增殖的作用 显著，且纯化过程的质量标准可控，故利于规模化的生产。所述用于促进细胞增殖的蝎毒多 肽BmKpp在促进细胞增殖和防护细胞应激性损伤(辐射等)药物的开发方面具有显著的优 点及广泛的应用前景。能够促进Y射线或者X射线照射后的小鼠骨髓造血细胞集落形成 以及M-NFS-60细胞的增殖。
图1是BmKpp的高效液相色谱图。图2是用质谱分析法测定BmKpp的分子量示意图。图3是BmKpp对M_NFS_60细胞的促增殖作用示意图。图4是BmKpp对辐射小鼠骨髓细胞集落形成的作用示意图。图 4 中A.辐射对照，B. SVP IV 3 μ g/ml, C. BmKpp 1 μ g/ml, D. BmKpp 3 μ g/ml
具体实施例方式本发明公开一种用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，其特征是从东亚钳蝎 (Buthusmartensii Karsch)蝎毒中分离、纯化而成，所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N 端30个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID No 1所示，其分子量为7212. 32830Da。本发明所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于它包括以下 步骤1)采集东亚钳蝎蝎毒成年东亚钳蝎取自金华市天道有毒生物科技开发有限公司下属的有毒生物种养 殖基地，利用电刺激法提取新鲜毒液，真空冷冻干燥、备用；2) SVP IV分离(1)凝胶过滤采用分子筛层析凝胶S印hadex G-50Medium对蝎毒粗毒溶液进行
5分离，层析柱规格为50cmX5. 5cm，收集峰II冻干，备用；(2)离子交换采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对峰II进行进一步 纯化，层析柱规格为IOOcmX 5. 5cm，洗脱液为ph = 6. 4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，其 中A液为0. 05M磷酸盐缓冲液(Na2HP04/NaH2P04)，B液为含0. 3M的A液，收集SVP IV，用 VIVAFL0W50切向超滤器脱盐，冻干，备用；3) BmKpp 纯化(1)离子交换采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对SVP IV进行进一 步纯化。层析柱规格为50cmX5. 5cm，洗脱液为ph = 6. 4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱， 其中A液为0. 05M磷酸盐缓冲液(Na2HP04/NaH2P04)，B液为含0. 3M的A液，收集目标峰，用 VIVAFLOff 50切向超滤器脱盐，冻干，备用；(2) HPLC分析流动相A液为0. 1 % TFA/H20, B液为70 %乙腈+0. 1 % TFA ；洗脱程 序为0 60min，B液浓度由0 100，洗脱速度为0. 5ml/min ；经分析，由离子交换所得的目 标峰——BmKpp的纯度可达95%以上，如图1所示；4) BmKpp分子量及其氨基酸序列测定用质谱分析法(Bruker公司的9. 4T混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS)测定BmKpp 的精确分子量为7212. 32830Da，如图2所示；用埃德曼降解法(Edman degradation)测定BmKpp N端30个氨基酸残基的序列 为MVDHFFQDDN NEMAVHHVNN AVDDDDTTNG经BLASTp比对的结果表明，BmKpp与已知蛋白的相似性均较低(< 35 % )，说明 BmKpp是一种新的多肽。下面通过具体实施例详细描述本发明的药用用途以下的实施例均以BmKpp促进细胞增殖为例对本发明进行具体的阐述，但是本发 明的保护范围并不局限于此，本技术领域的普通技术人员通过以上内容也能实现本发明的 目的。实施例一 =BmKpp促进细胞增殖r-h-MCSF 依赖细胞株 M-NFS-60 购自美国 ATCC 公司(CRL-1838 )。M-NFS-60 细 胞为悬浮生长，常规培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(青霉素100 U /mL，链霉 素 100 μ g/mL，HEPES 5958mg/L)中，加入 M-CSF 62ng/mL，于 37°C>5% CO2 条件下培养，隔 天换液1次，取对数生长期细胞用于实验。取生长状态良好的M-NFS-60细胞，用RPMI1640 洗涤3次，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬并调整细胞密度，按8X IO4个/ml的 密度，接种细胞悬液95 μ L于96孔板内，培养24小时后分别加入5 μ L生理盐水、不同浓度 的BmKpp、IL-3，每组设3个平行孔；常规培养24h或48h后，每孔加入10 μ LCCK-8试剂，把 培养板避光放入培养箱Ih后，用全自动酶标仪于450nm处测各组吸光度值，计算出增值率。不同浓度(0. 5 1. 5 μ g/mL) BmKpp明显促进细胞增殖，增殖率高于细胞因子IL-3 对照组，而且具有剂量效应关系(图3)。说明BmKpp具有促进细胞增殖作用。实施例二 =BmKpp促进细胞周期进程，细胞进入增殖期取对数生长期M-NFS60细胞，用不含血清的RPMI 1640培养液洗涤3次，加入生 理盐水(阴性对照)，IL-3 (10ng/mL,阳性对照)以及BmKpp 3 μ g/mL,作用24小时，取各组细胞制作标本，用于流式细胞仪检测细胞周期。制作标本的步骤如下制作浓度为1 5XlOVmL细胞悬液0. 5mL，加入70%冻乙醇2mL，_4°C过夜；1000rpm/min离心弃上清液； PBS洗两次；加入50 μ LRNA酶，450 μ LPI染料，4°C避光放置30min ；用流式细胞仪测定细 胞周期。结果显示，BmKpp使处于G0/G1期的细胞明显降低，而明显升高S期细胞的比例至 49.81% (表1)。BmKpp的作用于比SVP IV的作用显著，说明BmKpp能明显促进M-NFS60细 胞的周期进程，使多数细胞进入增殖周期。
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权利要求
用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，其特征是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离、纯化而成，所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N端30个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID №1所示，其分子量为7212.32830Da。
2.用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于它包括以下步骤1)采集东亚钳蝎蝎毒，利用电刺激法从成年东亚钳蝎体内提取新鲜毒液，真空冷冻干 燥成凝胶，备用；2)SVP IV分离，首先进行凝胶过滤采用分子筛层析凝胶S印hadex G-50Medium对蝎毒 粗毒溶液进行分离，收集峰II冻干，备用；然后进行离子交换采用CM Sepharose FF填料， 通过离子凝胶柱对峰II进行进一步纯化，用洗脱液为ph = 6. 4的磷酸盐缓冲液进行梯度 洗脱，收集SVP IV，用VIVAFL0W 50切向超滤器脱盐，冻干，备用；3)BmKpp纯化，首先进行离子交换采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对第 2)步形成的SVP IV进行进一步纯化，用洗脱液为ph = 6. 4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱， 收集目标峰，用VIVAFL0W 50切向超滤器脱盐，冻干，备用；然后用HPLC分析得知，由离子交 换所得的目标峰——BmKpp的纯度达95%以上。4)测定BmKpp分子量及其氨基酸序列，用质谱分析法测定BmKpp的精确分子量为 7212. 32830Da，用埃德曼降解法(Edman degradation)测定BmKpp N端30个氨基酸残基的 序列如序列表SEQ ID No 1所示。
3.如权利要求2所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于 前述第2)步中所用分子筛层析的层析柱规格为50cmX5. 5cm，所用离子凝胶柱规格为 lOOcmX 5. 5cm,所述洗脱液由A液和B液组成，其中A液为0. 05M磷酸盐缓冲液，该磷酸盐 缓冲液的分子式Na2HP04/NaH2P04，B液为含0. 3M的A液。
4.如权利要求2所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于前述 第3)步中所用离子凝胶柱规格为50cmX 5. 5cm,所述洗脱液由A液和B液组成，其中A液为 0. 05M磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的分子式为Na2HP04/NaH2P04，B液为含0. 3M的A液。
5.如权利要求2所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于前述 第3)步所用HPLC分析过程中，采用流动相A液为0. 1 % TFA/H20, B液为70 %乙腈+0. 1 % TFA ；洗脱程序为0 60min，B液浓度由0 100，洗脱速度为0. 5ml/min。
6.如权利要求2所述的用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于前述 第4)步所用质谱分析法，为Bruker公司的9. 4T混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS法。
7.用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的药用用途，其特征在于1)促进正常造血细胞增殖作用；2)促进辐射后骨髓造血细胞增殖。
全文摘要
本发明涉及用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途，用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，其特征是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离、纯化而成，所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽的N端30个氨基酸残基的序列如序列表SEQ ID №1所示，其分子量为7212.32830Da。所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽，是来源于东亚钳蝎蝎毒的一种新的多肽，并具有促进造血细胞(正常/辐射后)增殖的作用。BmKpp成分单一、精确分子量及N端30个氨基酸残基清楚，其促细胞增殖的作用显著，且纯化过程的质量标准可控，故利于规模化的生产。所述用于促进细胞增殖的蝎毒多肽在促进细胞增殖和防护细胞应激性损伤(辐射等)药物的开发方面具有显著的优点及广泛的应用前景。能够促进γ射线或者X射线照射后的小鼠骨髓造血细胞集落形成以及M-NFS-60细胞的增殖。
文档编号C07K1/18GK101979409SQ20101050815
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者孔天翰, 李婷, 王彩霞, 王燕, 董伟华, 蒋丽苑, 邢百倩, 邱轶芳, 郑跃钱 申请人:广州医学院