人miR-1908在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明基于基因工程领域，公开了人miR-1908在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。本发明的技术方案为人miR-1908在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。本发明的研究结果表明在人脂肪细胞中过表达miR-1908可以明显促进脂肪细胞的增殖速度和细胞个数，可用于制备促进脂肪细胞增殖的药物。
【专利说明】AmiR-1908在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及人miR-1908在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。
【背景技术】
[0002]肥胖已成为危害全球人类健康的重要问题之一，受到社会的广泛关注。随着经济发展和生活方式改变，中国的肥胖人口也急剧增长，且低龄化趋势十分突出。肥胖相关的各种并发症，如高血压、糖尿病和心脑血管疾病等，严重威胁着人类健康。《新英格兰医学杂志》一项调查显示中国糖尿病发病率已高达10%，且很大程度与肥胖有关。肥胖的科学治疗及其并发症的防治已成为临床医生面临的挑战。目前已知肥胖是机体在遗传、环境、行为因素或三者相互作用下能量代谢失衡的结果，并且随着遗传学和生物学的发展，遗传因素在肥胖发生中的重要性已倍受重视。已有研究结果指出，肥胖发生的病因中遗传因素占40-70%,开展肥胖病因的遗传学研究十分重要。
[0003]在前期研究工作中，发明人采用采用miRNA芯片(miRNA Array)技术筛选人脂肪
细胞分化前后的差异表达miRNA，获得一条特异高表达于成熟脂肪细胞的miRNA-------人
miR-1908，提示其可能与肥胖的发生发展相关。该miRNA位于人的第11号染色体上FADSl基因的第一个内含子内，属于基因内(Introgenic)miRNA。但目前没有关于人miR-1908在脂肪细胞中的功能报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是 提供人miR-1908在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。
[0005]发明人在研究中发现人miR-1908过表达组的细胞增殖速度明显快于空载对照组细胞，细胞个数明显增加，人miR-1908过表达组的脂肪细胞中S期细胞比例显著高于空载对照组，表明染色质合成期细胞较多，细胞增殖速度加快，可见人miR-1908能够显著促进脂肪细胞增殖，因此，本发明提出了人miR-1908在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用的技术方案。
[0006]本发明的有益效果:
[0007]本发明检测了人miR-1908过表达对脂肪细胞增殖功能的影响，显示过表达miR-1908能促进脂肪细胞增殖(细胞个数增多且增殖速度加快)，可用于制备促进脂肪细胞增殖的药物，为研究肥胖的发生发展提供了新的研究手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1:pGLV-Hl-GFP/Puro载体图谱、插入位点及人miR-1908过表达慢病毒载体酶切及测序鉴定结果。
[0009]图2:人miR-1908过表达慢病毒感染人脂肪前体细胞株的鉴定。
[0010]图3:人miR-1908过表达的脂肪细胞和对照细胞生长曲线图。[0011]其中:pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro:miR-1908 过表达的前体脂肪细胞，pGLV-Hl-GFP/Puro:空载转染对照细胞。
[0012]图4:人miR-1908的脂肪细胞和对照细胞0、24、48小时细胞各周期分布图。
[0013]其中:pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro:miR-1908 过表达的前体脂肪细胞，pGLV-Hl-GFP/Puro:空载转染对照细胞，Gl:染色质合成前期，S:染色质合成期，G2/M:染色质合成后期及分裂期。
【具体实施方式】
[0014]以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
[0015]实施例1
[0016]1.材料和方法
[0017]1.1 试验材料:人前体脂肪细胞株(Human Preadipocytes-visceral, HPA_v)购自美国Sciencell公司。本实验所需的pGLV-Hl-GFP/Puro质粒购自上海吉玛公司，包装质粒 Pcgvp> Rev、Vsvg 购自美国 Allele Biotech&Pharmaceuticals 公司；pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro慢病毒载体有本实验小组自行构建；RNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，miRNA逆转录试剂盒、miRNA检测试剂盒、TanMan基因表达mix II购自美国 ABI 公司，TaKaRa LA Taq? DNA Polymerase Hot-Start Version PCR 试剂盒购自日本Takara公司，脂肪细胞专有培养基7211购自美国Sciencell公司，限制性内切酶、T4连接酶购自美国NEB公司，引物有美国Invitrogen公司合成。
[0018]1.2实验方法:
[0019](一)人miR-1908minigene的扩增及人miR-1908慢病毒过表达载体(pGLV-Hl-miR-1908-GFP/Puro)的构建
[0020](I).DNA提取:按照以下步骤提取基因组DNA(德国Qiagen公司QIAamp DNAMiniKit)
[0021 ] I)取4ml离心管一只，加入600 μ I核裂解液，冰上冷却。
[0022]2)加入10_20mg解冻的人脂肪组织，匀浆机匀浆10秒。将裂解物移至1.5ml离心
管中。65°C孵育30分钟。
[0023]3)待样品达到室温后，加入200 μ I蛋白沉淀液，润旋震汤20秒，直于冰上冷却5分钟。
[0024]4) 13，OOOXg离心4分钟，可见白色沉淀。将上清移至一新离心管中。
[0025]5)加入600ul异丙醇，轻轻颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成。13，OOOXg离心I分钟,弃去上清。
[0026]6)加入600ul室温70%乙醇,轻轻颠倒离心管数次,13，OOOXg离心I分钟，小心弃去上清。将离心管倒置在干净的吸水纸上，自然干燥10-15分钟。
[0027]7)向离心管中加入50 μ I双蒸水，65°C孵育I小时，以充分溶解DNA，4°C保存。
[0028](2)人 miR_1908minigene 的扩增
[0029](2.1)通过miRBase数据库获得人miR-1908的前体pre-miRNA_1908的序列；在NCBIblast中比对查找其所在的基因组序列，根据引物设计规则，采用Primerf软件设计扩增包括pre-miR-1908在内的序列，并在其上游和下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，上游引物(含BamHI位点，下划线区域)5’ -GCCGGATCCCCACTGTCCCTATCCA-3 ’ ；下游引物(含EcoRI 位点，下划线区域)5’ -ACCGAATTCGGCACTTCTGCGTTT-3?,目的基因长度为 537bp。(PCR试剂盒:TaKaRa LA Taq? DNA Polymerase Hot-Start Version, Takara)
【权利要求】
1.人miR-1908在制备促进脂 肪细胞增殖药物中的应用。
【文档编号】A61P3/00GK103446592SQ201310361927
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】沈嵘, 倪毓辉, 郭锡熔, 季晨博, 杨蕾, 史春梅, 崔县伟, 付子毅, 苗苗 申请人:南京市妇幼保健院