一种用于诱导系统性硬化症模型的装置制造方法
【专利摘要】本发明属医学研究用生物器材领域，具体涉及一种用于诱导系统性硬化症模型的微渗透压泵装置。本发明包括Alzet微渗透压泵，脂多糖和博来霉素；所述的博来霉素溶液装载于Alzet微渗透压泵中，所述的脂多糖溶液包被于所述的泵表面。通过体内验证实验显示，皮下植入此泵装置后1～4周即出现皮肤炎症和纤维化，3～4周出现肺部炎症和纤维化，以及系统性的免疫应答紊乱。采用本装置诱导的研究模型，不但能够良好模拟系统性硬化症的发病特征，且操作过程简易，重复性强，对系统性硬化症发病机制和防治措施的研究具有重要意义。
【专利说明】一种用于诱导系统性硬化症模型的装置
【技术领域】
[0001] 本发明属医学研究用生物器材领域，涉及微渗透压泵装置。具体涉及一种用于诱 导系统性硬化症模型的微渗透压泵装置。
【背景技术】：
[0002] 硬皮病（scleroderma)是一种以皮肤及各系统组织纤维化为特征的结缔组织疾 病。一旦内脏受累又称为系统性硬化症（systemic sclerosis, SSc),此类患者病情趋于恶 化，5年生存率为34?80%。
[0003] 系统性硬化症发病机制错综复杂，目前研究结果认为，在遗传易感性基础上，由于 环境因素刺激而激活机体的炎症反应和自身免疫应答，进而血管内皮细胞受损，成纤维细 胞活化、增殖，大量合成细胞外基质，造成组织纤维化，随着病情发展，炎症消退，纤维化反 应仍不可逆转，最终导致多系统血管病变、组织纤维化和内脏功能衰竭，病情难以逆转，且 至今尚无有效治疗手段，因此，对系统性硬化症的发病机制和治疗靶点深入探讨已引起本 领域研究人员的关注。
[0004] 研究实践显示，建立稳定的体内、外研究模型，对于阐明发病机制和遴选治疗药物 具有非常重要的意义。实践显示，目前已知的模型均存在一定的局限性：1999年Yamamoto 等人采用博来霉素皮下注射制备了皮肤硬化动物模型，此模型以局限性皮肤纤维化为主， 内脏受累发生率低，且需要每日注射，工作量大，还易导致小鼠皮肤的局限性溃烂；紧皮鼠 (Tskl /+小鼠）是原纤维蛋白Ufibrill inl，FBNl)基因编码变异所致，可自发产生硬皮 病样改变，以弥漫性皮肤肥厚为特征，与人类硬皮病不同，紧皮鼠皮下组织异常增生，而真 皮层未受明显影响，易发展成肺气肿样改变而非纤维化反应，基本不出现血管病变，炎症改 变亦不明显；移植物抗宿主反应模型亦可表现为皮肤纤维化，皮肤脂肪层消失以及单核细 胞浸润，但相关品系小鼠获得成本高，培养环境要求较严格，不宜推广。目前已知，Alzet Osmotic Pumps是体积只有胶囊大小的渗透压泵，适合植入实验动物体内，针对特定部位 给药，或将药剂用导管导入作用部位，在生命科学实验研究中，Alzet pumps已成功的运 送上百种药剂，包括蛋白质，多肽，生长因子，基因研究及治疗中的Antisense和最新的干 扰RNA(RNAi)，抗生素，化疗药，激素，类固醇及其它短效期的化合物。通过ALZET Osmotic pumps持续给药可以建立多种疾病的动物模型，如高血压及Parkinson帕金森病的动物模 型，其在动物细胞给药、动物模型建构、药物及分子筛选、药理药代药效等众多领域发挥了 不可替代的作用。Alzet微渗透压泵作为一种利用微渗透压原理制备的组织相容性的药物 缓释系统，1987年Harrison JH等人采用微渗透压泵装载博来霉素（100mg/kg)皮下植入 C57BL/6小鼠4?8周诱导肺纤维化的动物模型。但目前尚无采用Alzet微渗透压泵制备 硬皮病研究模型的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种用于诱导系统性硬化症模型的装置，尤其涉及一种用 于诱导出稳定的系统性硬皮病模型的微渗透压泵装置。本发明所述的微渗透压泵装置具有 稳定性、重复性、可操作性和标准化的特点。
[0006] 本发明经过反复实验，摸索相关实验条件，采用Alzet微渗透压泵（可市购）局部 予以脂多糖急性刺激，辅以博来霉素缓释，能模拟系统性硬化症的发生，尤其适用于系统性 硬皮病发病机制和治疗靶点的研究及深入探讨。
[0007] 具体的，本发明的一种用于诱导系统性硬化症模型的装置，其包括Alzet 微渗透压泵（可市购），脂多糖和博来霉素，所述的博来霉素（Sigma)溶液装载于 Alzet (Model2004)微渗透压泵中，所述的脂多糖（LPS)溶液包被于所述的泵表面。
[0008] 本发明中，Alzet微渗透压泵（可市购）为Alzet(Model2004);
[0009] 本发明中，博来霉素（Bleomycin，BLM，Sigma)工作液浓度为12mg/ml，博来霉素以 0. 25ul/h的速度持续释放于外界环境；
[0010] 本发明中，脂多糖（LPS)生理盐水溶液浓度为100ng/ml ;
[0011] 本发明的用于诱导系统性硬化症模型的装置，其特征在于，通过下述方法制得：
[0012] 在无菌超净台中将博来霉素（Sigma)溶液装载于Alzet (Model2004)微渗透压泵 中，盖紧旋帽后浸于脂多糖（LPS)溶液，在37°C温箱中放置40小时备用；
[0013] 其中，博来霉素（Bleomycin，BLM，Sigma)工作液浓度为12mg/ml，博来霉素以 0. 25ul/h的速度持续释放于外界环境；
[0014] 脂多糖（LPS)生理盐水溶液浓度为100ng/ml。
[0015] 本发明基于：脂多糖可致组织细胞的急性损伤，并启动固有免疫应答的原理，将 脂多糖包被于泵表面，作用于机体后，可激发早期启动阶段的炎症反应和固有免疫应答； Alzet微渗透压泵借助与外界环境中的液体进行离子交换，使水分进入泵的可吸收层，膨胀 后在压力的作用下，使储液仓中的博来霉素以0. 25ul/h的速度持续释放于外界环境，在体 内实验中，微量的体液即可通过渗透压原理使微泵中的博来霉素作用于局部和血液循环； 博来霉素通过氧化应激、促进转化生长因子-β释放等机制导致组织炎症和纤维化。
[0016] 本发明的微渗透压泵装置进行了验证实验，结果表明：应用本泵装置可有效诱导 出系统性硬化症的体内、外研究模型，其作用可通过诱导成纤维细胞活化的方式实现。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是泵装置诱导小鼠皮肤纤维化病理改变，
[0018] 其中，A :博来霉素泵处理的模型组1周时Η&Ε染色；
[0019] B :博来霉素泵处理的模型组1周时Masson' s染色
[0020] C :生理盐水泵处理的对照组1周时H&E染色；
[0021] D :生理盐水泵处理的对照组1周时Masson' s三色染色；
[0022] 图2是泵装置诱导小鼠肺纤维化病理改变，
[0023] 其中，A :博来霉素泵处理的模型组4周时H&E染色；
[0024] B :博来霉素泵处理的模型组4周时Masson' s染色
[0025] C :生理盐水泵处理的对照组4周时H&E染色；
[0026] D :生理盐水泵处理的对照组4周时Masson' s三色染色。
【具体实施方式】：
[0027] 实施例1制备诱导系统性硬化症模型的泵装置
[0028] 用无菌生理盐水将博来霉素（Bleomycin, BLM，Sigma)稀释为12mg/ml工作液， 0. 22 μ m微孔无菌滤膜过滤后4°C保存，采用Iml注射器向微泵液体储存室注射244. 8微升 博来霉素工作液，盖紧流量控制帽，放置于lOOng/ml的脂多糖（LPS)生理盐水溶液中，制成 LPS+BLM泵装置，于37°C温箱孵育48小时后取出，备用。
[0029] 实施例2
[0030] 泵装置诱导小鼠系统性硬化症发生，建立系统性硬化症研究模型
[0031] 实验动物：雌性6?8周C57BL/6小鼠，体重18?20g，SPF级，本实验对动物的处 理均符合国际实验动物使用准则。
[0032] 采用水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，常规75%乙醇消毒皮肤后，在小鼠左后颈部下 Icm处开横向切口，将LPS+BLM泵装置头侧朝下埋植于小鼠皮下，手术缝合伤口，分别于植 入泵后的第1，2,3,4周处死小鼠，收集小鼠的外周血、皮肤、肺组织、脾脏和引流淋巴结进 行检测；对照组采用Alzet泵装载等体积生理盐水，余处理同实验组。
[0033] 采用SPSS16. 0统计软件进行分析，数据以均数土标准差（[土 s)表示，多组间比 较采用方差分析（ANOVA)进行比较，P < 0. 05为差异有显著意义。
[0034] 皮肤组织病理结果显示：
[0035] 与生理盐水对照组相比较，皮下植入LPS+BLM泵装置1周后，皮肤组织即可出现 大量炎性细胞浸润，真皮层增厚，成纤维细胞增生，胶原纤维沉积，造模后2?4周，炎性细 胞浸润逐渐消退，纤维化程度进行性加重，于第3周最为明显：表皮层变薄，真皮层增厚，大 量成纤维细胞聚集成灶，皮肤腺体减少，被纤维条索取代，第4周时表皮萎缩，真皮层胶原 变性，结果表明，本发明的LPS+BLM泵装置能诱导小鼠皮肤呈典型的"炎症水肿期-纤维化 期-萎缩期"的硬皮病病理改变；
[0036] 肺组织病理结果显示：
[0037] 与生理盐水对照组相比较，皮下植入LPS+BLM泵装置第3周后小鼠肺间质和肺泡 腔有大量炎症细胞浸润，肺组织结构尚完整；造模4周后肺间隔增厚，大量胶原纤维沉积， 肺泡腔结构紊乱，呈典型的"炎症水肿期-纤维化期"的间质性肺炎病理改变；
[0038] 免疫指标结果显示：
[0039] 采用流式细胞分析技术发现与生理盐水对照组相比较，皮下植入LPS+BLM泵装置 的小鼠引流淋巴结和脾脏中Th2(CD4+IL4 +)，Thl7(CD4+IL17+)，Th22(CD4+IL22+)的细胞比例 明显上调，采用ELISA检测皮损处和外周血中IL-Ιβ，IL-6, IL-4, IL-13, IL-17, IL-22和 TGF-β的水平，显示出明显上调。
[0040] 结果证实，本发明的LPS+BLM泵装置可诱导出皮肤、肺部的炎症和纤维化的病理 改变，以及特征性的免疫应答紊乱，符合系统性硬化症的发病特点，本LPS+BLM微渗透压泵 可作为诱导稳定的系统性硬化症体内研究模型的装置。
【权利要求】
1. 一种用于诱导系统性硬化症模型的装置，其特征在于，其包括Alzet微渗透压泵，月旨 多糖和博来霉素；所述的博来霉素溶液装载于Alzet微渗透压泵中，所述的脂多糖溶液包 被于所述的泵表面。
2. 按权利要求1所述的用于诱导系统性硬化症模型的装置，其特征在于，所述的Alzet 微渗透压泵为Alzet (Model2004)。
3. 按权利要求1所述的用于诱导系统性硬化症模型的装置，其特征在于，所述的博来 霉素工作液浓度为12mg/ml，博来霉素以0. 25ul/h的速度持续释放于外界环境。
4. 按权利要求1所述的用于诱导系统性硬化症模型的装置，其特征在于，所述的脂多 糖（LPS)生理盐水溶液浓度为100ng/ml。
5. -种制备用于诱导系统性硬化症模型的装置的方法，其特征在于，通过下述方法制 得： 在无菌超净台中将博来霉素溶液装载于Alzet (Model2004)微渗透压泵中，盖紧旋帽 后浸于脂多糖溶液制成LPS+BLM泵装置，在37°C温箱中放置40小时备用； 其中，博来霉素工作液浓度为12mg/ml，博来霉素以0. 25ul/h的速度持续释放于外界 环境； 脂多糖生理盐水溶液浓度为l〇〇ng/ml。
【文档编号】A61K38/14GK104367990SQ201310361919
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月16日 优先权日:2013年8月16日
【发明者】梁敏锐, 邹和建, 何睿, 吕娇艳 申请人:复旦大学附属华山医院