制备自体造血干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用的制作方法

制备自体造血干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种制备自体造血干细胞的方法，该方法包括：将体细胞在细胞培养液中培养3-6天，收集生成的自体造血干细胞，其中，所述细胞培养液是RPMI1640培养液，其中含有1-100μM的Y-27632（C14H21N3O·2HCl）；1-100ng/mL的干细胞因子；1-100ng/mL的白细胞介素3；1-100ng/mL的白细胞介素6；1-100ng/mL的白细胞介素11；1-100ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）；1-100ng/mL的粒细胞集落刺激因子（G-CSF）；1-100μg/mL的岩藻多糖；1-100μg/mL的硫酸葡聚糖；1-100nM的AMD3100（1,1′-[1,4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1,4,8,11-四氮杂环十四烷）；1-100μM的M-阿仑膦酸钠(Malendronate sodium trihydrate)；1-100μM的帕米膦酸二钠。由此，本发明提供了一种制备自体造血干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用，并且本发明提供的蛋白诱导性自体造血干细胞的生产方法在产量、纯度、生产速度及安全性方面具有显著优势。
【专利说明】制备自体造血干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用

【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域，具体来说，涉及制备自体造血干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用。

【背景技术】
[0002]干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是一类具备无限自我更新和分化潜能的早期胚胎细胞，是当受精卵分裂发育成囊胚时内层细胞图案的细胞，其具有可以向各胚层范畴的细胞分化的能力。成体细胞是指存在于人和哺乳动物特定组织或器官中(包括骨髓、神经、肌肉、表皮、睾丸或肾脏等)的具有修复和再生能力的干细胞，在特定条件下，成体干细胞产生新的干细胞或按一定的程序分化形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡，与胚胎干细胞不同的是，成体干细胞只可以向其定居的组织类型分化。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
[0003]几十年来，造血干细胞在临床上应用于血液系统疾病的治疗，被证明是治疗恶性血液疾病的有效方法。造血干细胞还被证明具有横向分化能力，具有分化形成骨细胞、神经细胞和心肌细胞等多种细胞的潜能。所以，自体造血干细胞还被广泛应用于再生医学和修复医学领域的多种疾病的再生性修复治疗。
[0004]由于异体或异种干细胞移植会不可避免地产生免疫排斥反应，自体干细胞已经成为现代生命科学发展的最重要的领域之一。人和动物出生后，机体内存留的造血干细胞数量极其稀少。因此，自体干细胞的来源困难和生产数量不足，一直是困扰着现代再生医学和自体组织器官工程的进一步发展。如何获得巨额数量的自体造血干细胞是当前国际干细胞疾病治疗的一个重大技术瓶颈。
[0005]近年来，应用基因重组技术已经证明，体细胞可以被重新编码而逆向分化，产生被称为诱导性自体多能干细胞(111(11106(1 ￠1111-11)01:6111: 8丨611111，1？3干细胞)，为自体干细胞的生产技术提供了新的途经。因此，利用体细胞逆向分化产生自体多能干细胞已经成为干细胞技术研发的热点。
[0006]目前造血干细胞的来源可分为三类:骨髓造血干细胞，动员周围血干细胞和脐带血干细胞。骨髓造血干细胞和动员周围血干细胞一般有核细胞数只达到5-10X107X8，0)34+细胞只达到1-5^1(^/? ；801111脐带血干细胞数量更少，⑶34+细胞只达到1-5父106。研究显示，在非血液病领域的疾病和创伤的修复治疗中，造血干细胞的用量与组织器官疾病及损伤修复的效果大小成正相关。以上三种造血干细胞的数量，还远远满足不了重大实质性组织器官疾病，如心脏病、大脑神经疾病和损伤、肝病、肾衰竭等等疾病的再生和修复治疗的需要，其疗效明显不足。
[0007]因此，有必要研究和开发出新的造血干细胞来源。此外，如何获得足够数量、高安全性的自体造血干细胞，是一个有待研发的医学生物学难题。


【发明内容】

[0008]针对现有技术中自体造血干细胞来源不足、可获取的数量少、和安全性低的问题，根据本发明的一个方面，提供了一种制备自体造血干细胞的方法，该方法包括:
[0009]采集人或动物的体细胞。获得的体细胞以5父106的密度接种于细胞培养皿中，换上细胞培养液。
[0010]优选地，采集人或动物的周围血液和/或骨髓液，应用常规？1(3011离心分离技术，离心、分离和获取血液单个核细胞。获得的单个核细胞以5X106的密度接种于细胞培养皿中，换上细胞培养液。
[0011]在制备自体造血干细胞的方法中，体细胞来源于人或动物的离体组织，包括血液、骨髓液、皮肤和脂肪中的一种或多种。
[0012]在制备自体造血干细胞的方法中，体细胞包括脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞和丨或脂肪细胞。
[0013]在371和5%的(?的环境中，将体细胞在细胞培养液中培养3-6天，所述培养液为1？？111640培养液。其中，培养液中含有:
[0014]1-100 9 1 的丫-27632.2此1),优选值为 10 9 1 ；
[0015]1-100118加[的干细胞因子，优选值为川叩/此；
[0016]1-10011^/1111的白细胞介素3，优选值为川叩/此；
[0017]1-10011^/1111的白细胞介素6，优选值为川叩/此；
[0018]1-10011^/1111的白细胞介素11，优选值为川叩/此；
[0019]1-10011^/1111的巨噬细胞集落刺激因子(1-(:310,优选值为川叩/此；
[0020]1-10011^/1111的粒细胞集落刺激因子优选值为川叩/此；
[0021]1-100 9 的岩藻多糖，优选值为10 9 ；
[0022]1-100 9 的硫酸葡聚糖，优选值为10 ；
[0023]1-100=1 的舰03100 (1, 1, -[1, 4-亚苯基二(亚甲基)〕-二-1，4，8，11-四氮杂环十四烧)，优选值为10118加1 ；
[0024]1-100 0 1 的 1-阿仑勝酸钠80(1111111 1:1-1117(111^6)，优选值为10111 ；
[0025]1-100 ^ I的帕米膦酸二钠，优选值为10 9 1。
[0026]轻轻吹打培养的细胞，使细胞完全悬浮后，收集细胞于离心管中，进行离心-生理盐水悬浮的细胞清洗操作，重复3次后，用生理盐水悬浮蛋白诱导性自体造血干细胞，得到自体造血干细胞。
[0027]将制备得到的自体造血干细胞冷冻保存，冷冻保存的方法为:将得到的自体造血干细胞以1 X 105个加1至1 X 106个加1的细胞密度与等体积的二甲基亚砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，将混合物降温至-801，然后转移到-1861的液氮中深低温保存。
[0028]在上述方法中，优选地，所使用的即11164培养液中含有:10^1的卜27632((^4?具0 -21101)510118/1111的干细胞因子；1011^此的白细胞介素3的白细胞介素6 ^10118/1111的白细胞介素11 ^10118/1111的巨噬细胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒细胞集落刺激因子9 8/此的岩藻多糖；10 9 8/此的硫酸葡聚糖；10111的舰03100(1, 1, -〔1，4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1，4，8，11-四氮杂环十四烷)；10 9 1的(1-阿仑勝酸钠)14611(11*011社6 80(1111111廿1117办社一；10 4 1的帕米勝酸二钠。
[0029]根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于制备自体造血干细胞的试剂盒。试剂盒包含一种细胞培养液(1^111640培养液),其中含有:
[0030]1-100 9 1 的 1-27632 (⑶⑶。.优选值为 10 1 ；
[0031]1-10011^/1111的干细胞因子，优选值为川叩/此；
[0032]1-10011^/1111的白细胞介素3，优选值为川叩/此；
[0033]1-10011^/1111的白细胞介素6，优选值为川叩/此；
[0034]1-10011^/1111的白细胞介素11，优选值为川叩/此；
[0035]1-10011^/1111的巨噬细胞集落刺激因子(1-(:310,优选值为川叩/此；
[0036]1-10011^/1111的粒细胞集落刺激因子优选值为川叩/此；
[0037]1-100 9 的岩藻多糖，优选值为10；
[0038]1-100 9 的硫酸葡聚糖，优选值为10；
[0039]1-100=1 的舰03100 (1, 1, -[1, 4-亚苯基二(亚甲基)〕-二-1，4，8，11-四氮杂环十四烧)，优选值为10118加1 ；
[0040]1-100 0 1 的 1-阿仑勝酸钠80(1111111 1:1-1117(111^6)，优选值为10111 ；
[0041]1-100^1的帕米膦酸二钠，优选值为10 9 1。
[0042]优选地，上述试剂盒中的细胞培养液(1^111640培养液)含有:10^1的卜27632((^4?具0 -21101)510118/1111的干细胞因子；1011^此的白细胞介素3的白细胞介素6 ^10118/1111的白细胞介素11 ^10118/1111的巨噬细胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒细胞集落刺激因子0 8/此的岩藻多糖的硫酸葡聚糖；10111的舰03100(1, 1, -〔1，4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1，4，8，11-四氮杂环十四烷)；10^1的1-阿仑勝酸钠80(1111111 廿丨]!#!'社一)；10 4 1 的帕米勝酸二钠。
[0043]在上述方法中，应用多种蛋白组成的细胞培养液，使人或小鼠的自体血液单个核细胞逆向分化，生产蛋白诱导性自体造血干细胞，我们称之为:蛋白诱导性自体造血干细胞(^1-01:6111 111(11106(1 11611181:010^10 81:6111
[0044]根据本发明提供的方法可以制备自体造血干细胞。自体造血干细胞可以用于建立自体造血干细胞库、制备抗衰老药物或保健品以及制备涉及器官再生再造和修复的疾病的药物。本发明提供的试剂盒可用于建立自体造血干细胞库。
[0045]本发明提供了一种制备自体造血干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用，并且本发明提供的蛋白诱导性自体造血干细胞的生产方法在产量、纯度、生产速度及安全性方面具有显著优势。

【专利附图】

【附图说明】
[0046]图1八至图10是从人血液单个核细胞逆向分化生产的人自体造血干细胞的形态及0)34和0)133特异表型鉴定图；
[0047]图12至图1?是从小鼠血液单个核细胞逆向分化生产的小鼠自体造血干细胞的形态及⑶34和⑶133特异表型鉴定图；
[0048]图1I至图1？是小鼠血液单个核细胞、小鼠自体造血干细胞的⑶34和⑶133特异表型鉴定比较图；
[0049]图2八是从人血液单个核细胞(9180逆向分化生产的人自体造血干细胞的流式细胞仪测视图；
[0050]图28是从人血液单个核细胞(9180逆向分化生产的人自体造血干细胞的转化率的曲线图；
[0051]图2(:是从小鼠血液单个核细胞(9180逆向分化生产的小鼠自体造血干细胞的转化率的曲线图；
[0052]图3八是此化八裸鼠静脉移植诱导性自体造血干细胞105天后的照片；
[0053]图38是84 V。裸鼠静脉移植816肿瘤细胞105天后的照片；
[0054]图3(:是此化八裸鼠皮下移植+静脉移植诱导性自体造血干细胞后105天的照片；
[0055]图30是此化八裸鼠皮下移植816肿瘤细胞105天后的照片；
[0056]图32是此化八裸鼠静脉移植816肿瘤细胞21天后产生的肺肿瘤的解剖图；
[0057]图3？是各试验组和对照组的肿瘤发生率柱状图。

【具体实施方式】
[0058]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0059]实施例1试剂盒的制备
[0060]在10-100级洁净度的安全操作台里操作，4-10度的低温条件下配制。在50001的醫1640培养液中，分别加入:10 4 1的1-27632 (0141121^30.的干细胞因子的白细胞介素3 的白细胞介素6 的白细胞介素11:10^/1111的巨噬细胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒细胞集落刺激因子):10^/III[的岩藻多糖；10?/此的硫酸葡聚糖；10=1的舰03100 (1,1, -〔1，4-亚苯基二(亚甲基)〕-二 -1，4，8，11-四氮杂环十四烧)；10 4 1 的 1-阿仑膦酸钠(1511611(11*011511:6 80(1111111廿土七办社一)；10 4 1的帕米膦酸二钠。
[0061]充分混合，溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液。
[0062]将细胞培养液置于试剂盒内，从而制成用于制蛋白诱导性自体造血干细胞的试剂盒。
[0063]实施例2小鼠的蛋白诱导性自体造血干细胞的制备
[0064]选择3-5月龄的此11^雄性小鼠(购买自中国医学科学院放射医学院(天津),动物合格证号:30? (津)2010-0002),采集其所有血液，使用常规？化011离心分离技术对血液进行离心、分离从而获取血液单个核细胞。将获得的单个核细胞以5X10^个加1的密度，接种于细胞培养皿中，并向其中加入实施例1中配制的细胞培养液，在371和5%的(?的培养箱中培养5天从而获得蛋白诱导性自体造血干细胞。轻轻吹打培养的细胞，使细胞完全悬浮后，收集细胞于离心管中，进行离心-生理盐水悬浮的细胞清洗操作，重复3次后，用生理盐水悬浮蛋白诱导性自体造血干细胞，得到蛋白诱导性自体造血干细胞。将得到的自体造血干细胞以1X10^个/01至1X10^个加1的细胞密度与等体积的二甲基亚砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，将混合物降温至-801，然后转移到-1861的液氮中深低温保存。
[0065]实施例3人的蛋白诱导性自体造血干细胞的制备
[0066]采集人体的外周血液5001，使用常规离心分离技术对血液进行离心、分离从而获取血液单个核细胞。将获得的单个核细胞以〖X 106个加1的密度，接种于细胞培养皿中，并向其中加入实施例1中配制的细胞培养液，在371和5%的002的培养箱中培养5天从而获得蛋白诱导性自体造血干细胞。轻轻吹打培养的细胞，使细胞完全悬浮后，收集细胞于离心管中，进行离心-生理盐水悬浮的细胞清洗操作，重复3次后，用生理盐水悬浮蛋白诱导性自体造血干细胞，得到蛋白诱导性自体造血干细胞。将得到的蛋白诱导性自体造血干细胞以1父105个加1至1父106个加1的细胞密度与等体积的二甲基亚砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，将混合物降温至-801，然后转移到-1861的液氮中深低温保存。
[0067]通过以下试验对实施例2及实施例3制得的进行类型性鉴定及安全鉴定。
[0068]试验1细胞特异表型鉴定
[0069]用已预先制得的聚-0-赖氨酸的载玻片，选择实施例2和实施例3中制备的非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞的最佳的细胞悬浮液浓度，用细胞制片离心机在1800%？下转动抛片2分钟制成玻片并做好标记，抛片上细胞密度(细胞均匀，密度适当兄抛片晾干后存放于-20度冰箱中冻存。从-20度冰箱中取出细胞玻片在室温晾干，在反面用记号笔划定区域。然后将实施例2制备的蛋白诱导性自体造血干细胞生理盐水悬浮液分别使用4%多聚甲醛(用？83配置，购自801^11^10公司，产品编号为？1010)固定，经过0.2%11~ 1^011 ^-100打孔10分钟以及磷酸盐缓冲液(983)的清洗后，使用10%正常山羊血清在室温的条件下封闭1小时，得到样品。重复进行样品制作步骤，使用实施例2中获得的蛋白诱导性自体造血干细胞制得样品八及样品8，使用实施例3中获得的蛋白诱导性自体造血干细胞制得样品及样品0。将第一抗体试剂兔抗鼠0)34加入样品4中；将第一抗体试剂兔抗人⑶34加入样品中；将第一抗体试剂兔抗鼠0)133加入样品8中；将第一抗体试剂兔抗人0)133加入样品0中。在41的条件下使四个样品中的抗原分别与第一抗体反应12小时(或过夜然后在使用磷酸盐缓冲液$83)清洗样品后，将第二抗体分别加入到四个样品中，第二抗体为使用？1扣标记的羊抗兔I姊(1:200 ；购买自⑶II公司，产品编号为八?1320。在室温的条件下使四个样品中的第一抗体分别与第二抗体反应1小时。然后，用0八?I (1:1000)进行染核，室温条件下进行1分钟。在使用磷酸盐缓冲液？83清洗后，对样品进行甘油封片操作，所使用封边剂为甘油外83封片剂(甘油#83=1:9, 1)118.0-8.5，美工生物公司制造最后使用尼康荧光显微镜观察拍照，在6-8小时内完成各种拍照。
[0070]试验结果见图1八至图1？，1八至图1？示出了细胞特异表型鉴定图，图1八至图10依次示出了从人血液单个核细胞逆向分化生产的人自体造血干细胞的形态及⑶34和0)133特异表型鉴定图；图12至图1?依次示出了从小鼠血液单个核细胞逆向分化生产的小鼠自体造血干细胞的形态及⑶34和⑶133特异表型鉴定图；图1I至图1？示出了小鼠血液单个核细胞、小鼠自体造血干细胞的⑶34和⑶133特异表型鉴定比较图。
[0071]其中，图1八和图18示出了未转化的人血液单个核细胞。
[0072]图X示出了实施例3制得的细胞在与一抗(兔抗人⑶34)及二抗(”扣标记的羊抗兔1^)反应后，可以在荧光显微镜观察到荧光部分(亮色区域),从而说明实施例3中所制得的细胞为人自体造血干细胞。
[0073]图10示出了实施例3制得的细胞在与一抗(兔抗人⑶133)及二抗(”扣标记的羊抗兔1^)反应后，可以在荧光显微镜观察到荧光部分(亮色区域),从而说明实施例3中所制得的细胞为人自体造血干细胞。
[0074]图12和图1示出了未转化的小鼠血液单个核细胞。
[0075]图％示出了实施例2制得的细胞在与一抗(兔抗人⑶34)及二抗(”扣标记的羊抗兔1^)反应后，可以在荧光显微镜观察到荧光部分(亮色区域),从而说明实施例2中所制得的细胞为小鼠自体造血干细胞。
[0076]图1?示出了实施例2制得的细胞在与一抗(兔抗人⑶133)及二抗(”扣标记的羊抗兔1^)反应后，可以在荧光显微镜观察到荧光部分(亮色区域),从而说明实施例2中所制得的细胞为小鼠自体造血干细胞。
[0077]试验2自体造血干细胞转化率的测定
[0078]方法一:流式细胞仪测定自体造血干细胞的转化率
[0079]试验原理:使用荧光免疫技术来标记⑶34、⑶133阳性细胞，通过检测标记的⑶34、⑶133阳性细胞来确定自体造血干细胞转化率(生产率)。
[0080]试验步骤:
[0081]1)解冻细胞:将实施例2及实施例3中制成并低温保存的人血液单个核细胞(^810及人自体造血干细胞以及小鼠血液单个核细胞(9810及小鼠自体造血干细胞的4份样品分别放入37度水浴锅中解冻。
[0082]2)将人体和老鼠的？810、人体和老鼠的分别转移到2？管中，在2500%？下常温下离心5111111。
[0083]3)除去上清液，每管加入400 9 I的封闭液1%8^用？83稀释)重悬浮细胞沉淀。
[0084]4)在 2500107 下常温下离心 5111111。
[0085]5)除去上清液，每管加入50 4 I的封闭液，重悬浮细胞沉淀。
[0086]6)管中加入20 4 [的⑶34抗体试剂。混匀之后放在黑暗处孵育30111111，之后进行流式细胞仪(美国801—10分析，自动计算标本中的⑶34阳性细胞数量及百分比。
[0087]试验结果见图2八，如图2八所示，图2八是从人血液单个核细胞(9180逆向分化生产的人自体造血干细胞的流式细胞仪测视图。通过流式细胞仪测定的自体造血干细胞的转化率可达38%。
[0088]方法二:免疫荧光技术检测⑶34、⑶133阳性细胞及计数
[0089]试验步骤:1)按照实施例2的制备方法制备？细胞，不同之处在于，培养时间分别为1天、2天、3天、4天、5天。制备得到5组小鼠的？样品。按照实施例3的制备方法制备？1即3细胞，不同之处在于，培养时间分别为1天、2天、3天、4天、5天。制备得到5组人的样品.
[0090]2)然后按照试验1的分组和方法进行细胞特异表型鉴定。在尼康荧光显微镜下，？110标记为绿色而0八？1标记为蓝色，计算十个境下视野的⑶34、⑶133特异染色细胞的平均数除予十个境下视野的细胞核①八?〗上色)的平均数，等于阳性细胞百分比。
[0091]试验结果
[0092]如图28和图2(:所示，图28是从人血液单个核细胞(9180逆向分化生产的人自体造血干细胞的转化率的曲线图；图2(:是从小鼠血液单个核细胞(9180逆向分化生产的小鼠自体造血干细胞的转化率的曲线图。由图28和图2(:可知，在第1天至第5天的培养期间，自体造血干细胞转化率具有上升的趋势，在第5天左右，转化率达到最高点，此时，样品的转化率均处于20%至40%之间。从图中还可以看出，通过⑶34、⑶133抗体表征的样品的转化率基本上是相同的，且180的转化率均处于20%至40%之间。
[0093]试验3自体造血干细胞的安全性鉴定
[0094]取1月龄裸鼠50只，雌雄各半，饲养于普通级环境中。将小鼠随机分为三组，其中自体造血干细胞组20只，肿瘤细胞组20只，空白对照组10只。
[0095]将自体造血干细胞组的20只小鼠随机分成两组(第一组和第二组),每组10只。第一组小鼠采取尾静脉移植的方式:将实施例2中制备的蛋白诱导性自体生殖造血干细胞以1 X 107个细胞/只的计量从尾部静脉注射入小鼠体内。第二组小鼠采取尾静脉注射与皮下注射同时进行的方式:将实施例2中制备的蛋白诱导性自体生殖造血干细胞以1乂107个细胞/只的计量通过尾静脉注射+颈背部皮下注射的方式注射入小鼠体内。
[0096]将肿瘤细胞组的20只小鼠随机分成两组(第三组和第四组),每组10只。第三组小鼠采用尾静脉移植的方式:将黑色素瘤(816)细胞以1 X 107个细胞/只的计量从尾部静脉注射入小鼠体内。第四组小鼠以皮下注射的方式:将黑色素瘤(816)细胞以1X10:个细胞/只的计量从颈背部注射入小鼠体内。
[0097]空白对照组的小鼠为第五组小鼠，将与以上各组体积相等的生理盐水以尾静脉注射+颈背部皮下注射的方式注射入小鼠体内。
[0098]注射完成后，将不同组别的小鼠分开饲养，并每日观察有无结节和肿瘤的形成。21天后处死半数小鼠，并进行病理检查。继续饲养剩余小鼠，观察12周后处死并作病理检查。
[0099]试验结果见图3八至图3？，图3八是84 V。裸鼠静脉移植诱导性自体造血干细胞后105天的照片；图38是84 V。裸鼠静脉移植816肿瘤细胞105天的照片；图30是8处八裸鼠皮下移植+静脉移植诱导性自体造血干细胞后105天的照片；图30是8413八裸鼠皮下移植816肿瘤细胞后105天的照片；图32是此化八裸鼠静脉移植816肿瘤细胞21天后产生的肺肿瘤的解剖图；图3？是各试验组和对照组的肿瘤发生率柱状图。
[0100]通过上述安全性试验，第一组、第二组及第五组小鼠在注射21天后以及12周后未发现一例具有瘤变迹象。而第三组及第四组小鼠在注射21天后部分部位发生瘤变，注射12周后，全部发现瘤变迹象。同时，接合柱状图可以看出，第一组和第二组注射自体造血干细胞后，发生肿瘤的概率为0，而第三组及第四组在注入816肿瘤细胞后，发生肿瘤的概率为100%。因此，使用本发明的方法制得的具有较高安全性。
[0101]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种制备自体造血干细胞的方法，包括: 将体细胞在细胞培养液中培养3-6天，收集生成的自体造血干细胞，其中，所述细胞培养液是醫11640培养液，其中含有1-100 9 1的1-27632 ((^?具0.2抝1) ； 1-100叩加1的干细胞因子的白细胞介素3:1-100118/1^的白细胞介素6 ； 1-1001^/4的白细胞介素11的巨噬细胞集落刺激因子(1-(:%)的粒细胞集落刺激因子(「(^?) ；1~100 11 的岩藻多糖；1-100化/此的硫酸葡聚糖；1-100111的舰03100(1, 1, -〔1，4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1，4，8，11-四氮杂环十四烷)；1-100 9 1的1-阿仑勝酸钠80(1111111 廿丨]!#!'社6) ； 1-100 4 1 的帕米勝酸二钠。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在即111640培养液中含有10^ 1的卜27632((^?具0 -2^01)^10118/1111的干细胞因子；1011^此的白细胞介素3 的白细胞介素6 ^10118/1111的白细胞介素11 ^10118/1111的巨噬细胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒细胞集落刺激因子9 8/此的岩藻多糖；10 9 8/此的硫酸葡聚糖；10111的舰03100(1, 1, -〔1，4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1，4，8，11-四氮杂环十四烷)；10^1的1-阿仑勝酸钠80(1111111 廿丨]!#!'社一)；10 4 1 的帕米勝酸二钠。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述细胞培养液中的培养条件为:温度为371和5%的(?环境。
4.根据权利要求1所述的方法，所述体细胞来源于人或动物的离体组织，包括血液、骨髓液、皮肤和脂肪中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体细胞包括脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞和丨或脂肪细胞。
6.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括:将制备得到的自体造血干细胞冷冻保存。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述冷冻保存包括:将得到的自体造血干细胞以IX 105个加1至IX 106个加1的细胞密度与等体积的二甲基亚砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，降温至-801，然后转移到-1861的液氮中深低温保存。
8.一种用于制备自体造血干细胞的试剂盒，包括: 细胞培养液，所述细胞培养液是即111640培养液，其中含有1-100 ^ 1的卜27632.21101) ；1-100耶姐的干细胞因子；1-100耶姐的白细胞介素3 ； 1-100^/III[的白细胞介素6 ； 1-100118/1111的白细胞介素11 ； 1-100118/1111的巨噬细胞集落刺激因子(1-(:%) ； 1-10011^/1111的粒细胞集落刺激因子； 1-100 ^ 8/此的岩藻多糖；1-100 9 8/此的硫酸葡聚糖；1-100=1的舰03100 (1, 1 1 -〔1，4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1,4，8，11-四氮杂环十四烧〉；1-100 9 1 的 1-阿仑勝酸钠80(1111111； 1-100 4 1 的帕米膦酸二钠。
9.一种用于制备自体造血干细胞的试剂盒，包括: 细胞培养液，所述细胞培养液是即111640培养液，其中含有10 ^ 1的卜27632((^?具0 -2^01)^10118/1111的干细胞因子；1011^此的白细胞介素3的白细胞介素6 ^10118/1111的白细胞介素11 ^10118/1111的巨噬细胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒细胞集落刺激因子9 8/此的岩藻多糖；10 9 8/此的硫酸葡聚糖；10111的舰03100(1, 1, -〔1，4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1，4，8，11-四氮杂环十四烷)；10^1的1-阿仑勝酸钠(Malendronate sodium trihydrate) ;10 μ M 的帕米勝酸二钠。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒在建立自体造血干细胞库中的应用。
11.根据权利要求1-7任意一项所述的方法制备的自体造血干细胞。
12.根据权利要求11所述的自体造血干细胞在建立自体造血干细胞库中的应用。
13.根据权利要求11所述的自体造血干细胞在制备抗衰老药物或保健品中的应用。
14.根据权利要求11所述的自体造血干细胞在制备涉及器官再生再造和修复的疾病的药物中的应用。
【文档编号】A61K35/28GK104419660SQ201310361684
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】林雄斌, 林柳吟 申请人:林雄斌