一种胎盘造血干细胞的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种胎盘造血干细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002] 造血干细胞（HemopoieticStemcell，HSC)是存在于造血组织中的一群原始造血 细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液中。造血干细胞是所有造血细胞和免 疫细胞的起源，具有自我更新和多向分化能力。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过 一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向 分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
[0003] 随着对造血干细胞（HSC)日渐深入的研宄，HSC移植已经成为治疗许多恶性血液 系统疾病及其他肿瘤的有效手段。目前，HSC的主要来源是骨髓、外周血及脐血，骨髓和外 周血HSC增殖和分化能力下降，并且易受供者健康状态影响，而脐血HSC数量有限，这些限 制因素使其不能满足日渐增长的HSC临床应用需求。近年来，国内外学者研宄发现，胎盘中 含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。这些干细胞在胎盘中行使着造血的 功能。小孩出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，是脐带血的8-10倍，可供小孩自用几 次，甚至可提供给多个成人患者的治疗。胎盘造血干细胞的成功分离和提取可解决临床上 HSC的来源问题，具有广阔的临床应用前景。
[0004] 目前，胎盘HSC的分离提取方法主要采用机械法、机械酶解法等，但这两种方法提 取过程操作繁复、耗时长、成本高，不太适用于大规模的生产制备。
[0005] 中国专利CN103789262A公开了一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其 以酶解灌注法进行造血干细胞的制备，最终获得的⑶34阳性细胞数在1. 2-1. 6X109,但 是，该方法在酶解时间极短的前提下，该效果数据基本不可能达到十亿级，并且经过对该专 利方法试验验证，其单个核细胞总数最高在1〇 8数量级，单个核细胞活率较低，在60-65 %， CD34阳性细胞仅在105数量级，明显与其记载的试验结果不相符。
[0006] 同时，从其提供的流式检测图可知，只有FSC/SSC检测的细胞图，这个流式图代表 的是细胞检测数量，且其提取出来的细胞并未经过流式CD34抗原的检测，其总提取细胞是 单个核细胞，并非CD34阳性细胞。进行流式检测一般是对提取细胞进行重悬后（总体积V)， 取少量细胞悬液（检测体积VI)、细胞数量约为IX106cell，进行染色后上机检测。根据检 测细胞中CD34阳性的细胞含量，从而计算出总细胞中含有的CD34阳性的细胞。
[0007]虽然，上述现有专利以酶解灌注法进行胎盘造血干细胞的制备，虽然相比机械法 和机械酶解法更简便，耗时短、成本低，但是最终获得的细胞数量和活力却不够理想，需要 进一步进行改进。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胎盘造血干细胞的制备方法，使得所述制 备方法能够提包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量以及CD34阳性细胞数 量。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0010] 一种胎盘造血干细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0011] 步骤1、胎盘预处理后，用灌洗液灌注清洗胎盘；
[0012] 步骤2、将酶解液从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出酶解液停止并结扎胎盘动静脉 静置，所述酶解液为包括I型胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶、枸橼酸盐缓冲溶液、青-链霉 素双抗、罂粟碱、N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基；
[0013] 步骤3、松开胎盘动静脉并从动脉灌注所述灌洗液，从静脉处收集全部酶解液体， 离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单 个核细胞，重悬后获得所述胎盘造血干细胞。
[0014] 针对现有酶解灌注法获取的胎盘造血干细胞数量以及活率不高的问题，本发明 从改进酶解液组成出发，以多种适宜的组分组成全新的酶解液，使其不仅能够动员胎盘内 部的造血干细胞并在短时间内迅速进入血液循环系统，同时提高了造血干细胞的数量和活 率，解决了现有技术的问题。
[0015] 本发明所用胎盘由某医院妇产科提供，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性 且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙 烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘保存液，采集后4°C条件下12小时内送到制备处分 离制备胎盘造血干细胞。
[0016] 本发明技术方案中所用试剂均市售获得，例如DMEM高糖基础培养基可购自于 Gibco公司。
[0017]作为优选，步骤1所述灌洗液灌注清洗胎盘为：
[0018] 将0-4°C灌洗液灌注进胎盘中的动脉，直至胎盘内血清清洗干净。
[0019] 为了进一步配合所述酶解液，共同作用于胎盘制备出大量高活力的胎盘造血干 细胞，本发明所述灌洗液优选为包括青-链霉素双抗、EDTA、枸橼酸盐缓冲溶液、罂粟碱和 N-乙酰半胱氨酸的PBS缓冲液；更优选地，所述灌洗液为包括1-3倍的青-链霉素双抗、 0? 01-0. 04% (质量百分比）EDTA、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、0? 01-0.lmg/mL的罂粟碱和 0. 5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值为7. 0的PBS缓冲液；最优选地，所述灌洗液为包 括1倍的青-链霉素双抗、〇. 02%EDTA、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、0. 05mg/mL的罂粟碱和 1. Ommol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值为7. 0的PBS缓冲液。
[0020] 本发明所述1-3倍的双抗或1倍的枸橼酸盐缓冲液均为本领域常规的试剂浓度表 示方法，一般所购买的青-链霉素双抗或所配置的枸橼酸盐缓冲液均为高倍母液，在使用 时会稀释配置成低倍数，如所购买的青-链霉素双抗多数为100倍，而枸橼酸盐缓冲液一般 配制成5倍或10倍，其配制方法如磷酸缓冲液属于本领域公知，作为优选，本发明提供5倍 枸橼酸盐缓冲液配制方法，如下：
[0021] 称取枸橼酸钠粉末26. 3g、枸橼酸粉末3. 27g、葡萄糖12. 7g、磷酸二氢钠4. 44g、腺 嘌呤0. 55g，把上述各组分溶于400mL的去离子水中，充分搅拌混匀后形成5倍枸橼酸盐缓 冲溶液，0.22ym过滤，分装。
[0022] 在本发明所述制备方法的起始阶段，需要对胎盘进行预处理，这一措施属于本领 域公知，即对胎盘进行消毒、除去胎盘羊膜以及洗涤等步骤，在制备造血干细胞前，本领域 技术人员均知晓这些预处理步骤并能够根据实际情况选择具体的预处理步骤。作为优选， 本发明预处理为剥离羊膜并用灌洗液清洗胎盘。
[0023] 作为优选，所述酶解液为包括0. 01-0.lmg/mL的I型胶原酶、0. 01-0.lmg/mL的 透明质酸酶、〇. 001-0. 005% (质量百分比）的胰蛋白酶、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、1倍的 青-链霉素双抗、〇. 01-0.lmg/mL的罂粟碱、0. 5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖 基础培养基。
[0024] 更优选地，所述酶解液为包括0. 05mg/mL的I型胶原酶、0. 02mg/mL的透明质酸 酶、0.001 % (质量百分比）的胰蛋白酶、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、1倍的青-链霉素双抗、 0. 05mg/mL的罂粟碱、1.Ommol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基。
[0025] 作为优选，所述羟乙基淀粉法具体步骤为：
[0026] 将细胞沉淀和羟乙基淀粉按体积比细胞沉淀：羟乙基淀粉=1:1-3的比例，用羟 乙基淀粉重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，吸取上清离心，离心后弃上清。
[0027] 作为优选，所述红细胞裂解法具体步骤为：
[0028] 将经羟乙基淀粉法处理后的细胞沉淀和1倍的红细胞裂解液，按体积比细胞沉 淀：1倍红细胞裂解液=1:5-10的比例，用1倍的红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋振荡 5s，室温下裂解残留的红细胞lOmin，离心后弃上清获得包含造血干细胞的单个核细胞。
[0029] 作为优选，步骤3所述重悬以DMEM高糖基础培养基重悬。
[0030] 在造血干细胞数量和活率的对比试验中，以本发明所述制备方法和专利 CN103789262A进行对比，结果显示，在包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量、 ⑶34阳性细胞数量上均显著高于现有对照方法。
[0031] 由以上技术方案可知，本发明改善酶解灌注法工艺，选择多种相互适宜的组分组 成新型酶解液应用于胎盘造血干细胞制备过程中，不仅能够动员胎盘内部的造血干细胞并 在短时间内迅速进入血液循环系统，而且同时提高了包含造血干细胞的单个核细胞数量及 其活细胞数量以及CD34阳性细胞数量。
【附图说明】
[0032] 图1所示为实施例1制备的造血干细胞不加抗体的流式检测图（对照组）；
[0033] 其中，图1-A为检测单个核细胞总数的流式检测图，所圈区域P2即表示单个核细 胞总数所占百分比（5. 4% )，图1-B为检测CD34阳性细胞数的流式检测图，右侧百分比为 CD34阳性细胞在单个核细胞中的百分比；
[0034] 图2所示为实施例1制备的造血干细胞加抗体的流式检测图（检测组）；
[0035] 其中，图2-A为检测单个核细胞总数的流式检测图，所圈区域P2即表示单个核细 胞总数所占百分比（5. 2% )，图2-B为检测CD34阳性细胞数的流式检测图，右侧百分比为 CD34阳性细胞在单个核细胞中的百分比。
【具体实施方式】
[0036] 本发明实施例公开了一种胎盘造血干细胞的制备方法。本领域技术人员可以借鉴 本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技 术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的产品及 方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0037] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种胎盘造血干细胞的 制备方法进行详细说明。
[0038] 实施例1 :本发明所述胎盘造血干细胞的制备方法
[0039] 选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇 知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘 保存液，采集后4°C条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。
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