抑制STAT3表达和防治慢性移植物抗宿主病的shRNA及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种shRNA，特别设及一种可抑制STAT3表达和防治慢性移植物抗宿 主病的shRNA小分子祀向药物及其应用。
【背景技术】
[0002] 慢性移植物抗宿主病 kbonic graft versus host disease, cGVHD)是异基因 造血干细胞移植（allogeneic hemapoietic stem cells transplant, allo-HSCT)长期存 活患者的主要并发症，不仅严重影响患者的生存质量，也是导致非复发死亡的主要原因。随 着allo-HSCT的广泛开展，约30%~70%患者可在移植后中位4~6个月发生不同程度的 cGVHD，严重限制了 allo-HSCT的应用和发展。GV皿主要是由于有免疫活性的供体来源T细 胞与受体组织反应的结果。目前研究认为，cGV皿主要是由于供者自身反应性T细胞的活化 所引发的免疫排斥，现有免疫抑制治疗多W抑制T细胞活化为主要出发点，尽管运些措施 能够在一定程度上减少移植排斥，但是仍存在白血病等复发，甚至由于过度免疫抑制而引 发致命性感染、继发第二肿瘤等并发症，而抑制不足则导致cGV皿难W控制。寻找更有效、 更精确调控机体免疫抑制效果的新策略是移植领域研究的热点，亦可能是解决移植排斥并 发症的根本出路。
[0003] 近年来，利用RNA干扰技术，将化学合成的短发夹干扰RNA(shod hai巧in RNA， ShRNA)转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最有效的手段之一，也是 祀向基因治疗最有吸引力的方法之一。选择特异性的祀基因合成有效的ShRNA,并且选择 合适转染方式，使其在宿主细胞中高效作用，是实施运一祀向治疗措施的重点。有效的祀 向治疗是目前国内外不断在寻找的治疗方法。幼稚CD4+Th细胞可W被活化并分化成熟为 有不同功能的效应性化细胞。化17细胞是在自身免疫性疾病发病机制的研究中，新发现 一个分泌IL-17,但其分化不依赖于化1或化2分化所需的细胞因子和转录因子的CD4+T 细胞亚群。化17细胞在自身免疫性疾病和移植排斥领域有较广泛的研究，但有关化17在 GV皿发生发展中的作用，近年才开始引起学者关注。我们的前期研究应用基因表达谱忍片 发现STAT3及IL-17A、比-21在cGVHD病人表达升高，并且发现cGV皿患者外周血中存在 化17 t /Treg I失衡。新近研究发现：JAK/STAT信号转导途径是化细胞极化的重要通路， 其中信号转导及转录激活因子3 (si即曰1 transducer and activator of transcription 3) STAT3是化17细胞分化的信号转导通路的核心是T细胞向化17或化eg分化的"支点"， 调控化17和Treg之间的动态平衡。
[0004] 我们在前期研究基础上结合免疫领域最新热点，首次提出通过阻断STAT3,对 Thl7/Treg平衡进行调控，从而达到抑制cGV皿的研究思路。探讨阻断STAT3信号对诱导 化17、Treg分化及其相互调控的作用及机制，阐明化17/Treg "漂移"在cGV皿发生发展过 程中的作用，为进一步寻求cGV皿的免疫治疗新祀点提供实验依据。祀向针对STAT3基因 的shRNA序列对于开发新的抗cGVHD基因药物和提高cGV皿的治疗效果有重要的意义，具 有广阔的应用前景和经济价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的在于提供一种能高效抑制STAT3表达和防治慢性移植物抗宿 主病的shRNA。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抑制STAT3表达和防治慢性移植物抗 宿主病的shRNA，合成序列如下所示：
[0007] 正义链：
[0008]日' -TCGACTTTGATTTCAACTACAACTCGAGTTGTAGTTGAAATCAAAGTCGTTTTTTC-3，反义 链：
[0009] 5 ^ -TCGAGAAAAAACGACTTTGATTTCAACTACAACTCGAGTTGTAGTTGAAATCAAAGTCGA-3 ^
[0010] 所述的shRNA应用于抑制STAT3基因（NM_213659)的表达。祀向序列为 ACTTTGATTTCAACTACAA。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种可高效抑制或治疗慢性移植物抗宿主病的药物。
[0012] 该药物含有如上所述的ShRNA作为药物的活性成分。该药物是通过慢病毒载体感 染宿主细胞将shRNA药物整合至目的基因组，从而抑制STAT3基因表达和防治慢性移植物 抗宿主病。
[0013] 制备上述可高效抑制或治疗慢性移植物抗宿主病的药物步骤如下：
[0014] 针对小鼠STAT3基因序列，利用公用网站中提供的RNA干扰（RNAU序列设计原 贝1J，针对不同的祀点设计3条RNA干扰序列及RNAi阴性对照序列，选择最佳的动力学参 数祀点进入后续实验流程。合成含有干扰序列的单链DNA oligo,然后退火配对产生双 链。通过慢病毒感染宿主细胞达到将ShRNA药物整合至目的基因组，其制备过程为：将合 成的双链ShRNA,通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体上；将连接产物 转入制备好的细菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子后，送测序验证；测序结果经比对确认 正确的克隆即为构建成功的目的基因RNAi及阴性对照慢病毒载体质粒。同时制备重组慢 病毒质粒的两种辅助包装原件载体质粒，=种载体质粒分别进行高纯度无内毒素抽提，按 Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，收集富含慢病毒颗 粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒 滴度。免疫磁珠分选小鼠脾CD4-CD62L-|m丫vcT细胞，活化7化后感染STAT3-shRNA及阴性 对照慢病毒，9化留取各组细胞，提取RNA，逆转录合成cDNA，巧光定量PCR(染料法）验证 mRNA水平的STAT3干扰效果，筛选出权利要求1所述的shRNA用于正式实验。
[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0016] 1、本发明的抑制STAT3表达的shRNA是通过慢病毒感染小鼠脾 CD4-CD62L-naTvcT细胞，经检测干扰效果筛选得到的；能高效抑制STAT3基因的表达，与阴 性对照组比较，mRNA水平的下调程度达到52倍左右，如图1、2,表3所示。
[0017] 2、本发明的抑制STAT3表达的ShRNA通过慢病毒载体作用于小鼠脾 CD4XD6化-naVvcT细胞后，影响各亚群分化方向（如表4)，其中化17比例降低，Treg比 例增高（如图3、4所示），Thl7/Treg比值降低，与阴性对照组比较，差异有统计学意义 (P<0. 05)。
[0018] 3、本发明的抑制STAT3表达的shRNA通过慢病毒载体作用于小鼠骨髓CD117+早 期干祖细胞后（图5)，巧光定量PCR检测STAT3-shRNA慢病毒感染小鼠骨髓CD117+早期干 祖细胞9化时STAT3基因的相对表达量（内参照基因为GAPDH)，与阴性对照组、空白对照组 比较，STAT3-shRNA干扰组STAT3基因在mRNA水平的相对表达量均数的差别均有统计学意 义任<0.001，P<0.001);阴性对照组与空白对照组比较，STAT3基因在mRNA水平的相对表 达量均数的差别无统计学意义（P = 0. 063)(图6)。干扰组细胞增殖活力（如表5、图7)、 早期调亡率（如表6、图8)及体外分化为各系造血集落的能力（如表7、图9)，与对照组比 较，均无显著性差异（P〉〇. 05)，说明其安全性。
[0019]4、本发明的抑制STAT3表达的shRNA应用于活体内治疗小鼠cGV皿模型，cGV皿临 床评分（如表8、图10)及祀器官病理评分（如表9、图11-12)均降低，与阴性对照组比较， 差异有统计学意义（P<〇. 05)。
[0020] 5、设及STAT3基因的shRNA序列对于开发新的抗cGVHD基因药物和提高cGV皿的 治疗效果有重要的意义，具有广阔的应用前景和经济价值。
[0021] 本发明的ShRNA可用于抑制STAT3基因的表达，用于制备治疗慢性移植物抗宿主 病的小分子祀向药物，通过慢病毒载体感染并整合至目的细胞基因组，沉默STAT3基因的 表达，发挥治疗作用。
【附图说明】
[0022] 图1是实施例1中通过巧光显微镜观察STAT3-shRNA慢病毒感染小鼠 CD4*CD技2L：%泡veT细胞，其中（a)是空白对照组在200倍白光度ri曲t)情况下所进行的显 微镜观察；化）是空白对照组在200倍巧光（GF巧情况下所进行的显微镜观察；（C)是空白 对照组在200倍白巧光融合（Merge)情况下所进行的显微镜观察；（d)是shRNA2组在200 倍白光度ri曲t)情况下所进行的显微镜观察；（e)是shRNA2组在200倍巧光（GFP)情况 下所进行的显微镜观察；（f)是shRNA2组在200倍白巧光融合（Merge)情况下所进行的显 微镜观察。
[002引 图2是实施例1中通过巧光定量PCR检测STAT3-shRNAl、2、3慢病毒及阴性对照 病毒感染小鼠脾拉换化瓜粧L+n疏妃T细胞9化时STAT3基因的mRNA水平相对表达量。
[0024] 图3是实施例2中通过流式细胞术检测STAT3-shRNA2慢病毒及阴性对照病毒感 染小鼠脾〔04-(；'0(。丄-11献灯细胞96^寸〔04乂025中(卿3+化6邑亚群细胞，其中（曰）表示设 口，紫色代表干扰组CD4+的细胞群，化）表示干扰组Treg亚群细胞同型对照，（C)表示干扰 组Treg亚群细胞，（d)表示设口，紫色代表阴性对照组CD4+的细胞群，（e)表示阴性对照组 Treg亚群细胞同型对照，（f)表示阴性对照组Treg亚群细胞。
[00巧]图4是实施例2中通过流式细胞术检测STAT3-shRNA2慢病毒及阴性对照病毒感 染小鼠脾CD4了D62L.-nalfveT细胞9化时CD4+比-17A+Thl7亚群细胞，其中（a)表示设口， 紫色代表干扰组CD4+的细胞群，化）表示干扰组化17亚群细胞同型对照，（C)表示干扰组 化17亚群细胞；（d)表示设n，紫色代表阴性对照组CD4+的细胞群，（e)表示阴性对照组 化17亚群细胞同型对照（f)表示