一种stat3抑制剂-egcg在结肠癌治疗方面的应用的制作方法
【专利摘要】Stat3信号传导系统调控异常普遍存在于癌变细胞株中，本发明提供了一种化合物EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)是有效的Stat3的抑制剂，能够应用于含有内源性激活的Stat3信号通道的癌症治疗药物的制备中。
【专利说明】—种STAT3抑制剂-EGCG在结肠癌治疗方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种信号传导系统抑制剂化合物在制备治疗结肠癌药物方面的应用。【背景技术】
[0002]据WHO统计，全世界恶性肿瘤每年发病1100多万人，病死800多万人，发达国家肿瘤年发病率高于300/10万。新中国成立初期，恶性肿瘤仅占死因的第9-10位，到20世纪70年代上升到第3位。据国家卫生资料统计，近两年来我国城市居民恶性肿瘤占死亡原因的第I位且每年新增患者约220万人。WHO不久前在日内瓦发表最新《世界癌症报告》说，到2020年，全球癌症发病率可能比现在增长50%以上，新增肿瘤患者将达2000万人。
[0003]STAT3 (signal transducer and activator of transcription-3, STAT3)即细胞信号转导和转录激活因子3是一种将细胞外信号转运至核内的转录因子，可被磷酸化而激活，成为活化的STAT3即P-STAT3，参与细胞的生长，增殖，凋亡等一系列重要的病理生理过程，正常信号转导中STATs的激活是快速而短暂的，Stat3的激活对于细胞的生长、凋亡、细胞周期的调控都有重要的影响，而Stat3自身又受到细胞内多种信号转导途径的调控。
[0004]Stat3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道汇集的焦点，在多种肿瘤细胞和组织中都有过度激活，如乳腺癌、头颈癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌和各种白血病等。Stat3激活后诱导上述与细胞增殖、分化、生存、凋亡密切相关的关键基因的异常表达，通过各种途径促进细胞增殖、恶性转化，阻碍细胞凋亡，表现出致癌作用，因此Stat3已被认为是一种癌基因。
[0005]尽管Stat3参-与正常细胞因子信号的调节，但在越来越多的肿瘤细胞中发现了 Stat3的持续高表达,而且有证据显示Stat3参与了肿瘤的形成,表明Stat3有可能成为肿瘤治疗中一个新靶点，以下简要介绍在试验治疗中阻断STAT3信号通路方面取得的进展。(I).酪氨酸激酶抑制剂:针对STAT3信号途径上游酪氨酸激酶如JAK，Src, EG FR的抑制剂已经研究成功，部分已进入临床各期试验，AG490是酪氨酸激酶选择性抑制剂，可以阻断JAK激酶活性，进而影响STAT3激活，从而显著抑制表皮细胞的生长，诱导细胞的凋亡。(2).寡核苷酸:一种是反义寡核苷酸(antisense olig-onucleotide AS-0N),能与STAT3mRNA结合组合阻止STAT3的翻译，另一种是诱馆寡核苷酸(decoy oligonucleotide,Decoy ON)，指一段双链寡核苷酸，它与STAT3靶基因启动子反应元件中STAT3识别的特异性靶DNA序列相一致，能竞争性结合活化的STAT3，减少STAT3与特异性反应性元件的结合从而阻断STAT3信号途径。(3)RNA干扰:RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA(double strandedRNA, dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(Postoranscriptionalgene silencing, PTGS),其机制可能是细胞内dsRNA在Dicer酶(dsRNA特异性核酸内切酶)的作用下，可形成22bp大小干扰的小干扰RNA (small interfering RNA, si RNA), si RNA可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease,KISC),并使其激活从而精确降解与SiRNA序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内翻译和表达，由于目前尚没有合适的转基因技术，RNAi在临床治疗上的应用有待于进一步研究。(4)显性负性蛋白，一类是野生型显性负性蛋白，另一类是突变性显性负性蛋白。(5)受体拮抗剂:研究证实，多种细胞外信号通过细胞表面受体激活STAT3信号转导通路，理论上应用此受体的拮抗齐！J就可以达到阻断该受体活化而明显抑制STAT3活化的目的。(6)其它:STAT3通过酪氨酸磷酸化而被激活，而蛋白磷酸酶可使活化状态的STAT3去磷酸化，从而抑制STAT3活性，其中SHP是STAT3信号传导通路持续激活，PIAS可以抑制STAT3活性而对此通路产生负调节作用。本发明是使用有机小分子EGCG与Stat3蛋白SH2功能域相互作用，阻断Stat3磷酸化过程，从而抑制Stat3相关的信号传导途径。
【发明内容】
[0006]癌基因Stat3与结肠癌的发生、发展密切相关，Stat3信号通道的过度激活破坏了正常细胞的增殖、凋亡，能够诱导出某些转化细胞的特性，过度表达的Stat3调节了细胞周期和凋亡活动，阻断Stat3信号通道也许能预防和治疗人类肿瘤。在这项专利申请的内容中，我们用一系列生物实验证明了表没食子儿茶素没食子酸酯-EGCG ( 一种Stat3小分子抑制剂)是能够显著抑制结肠癌细胞HCT116的生长。在体外实验中EGCG能抑制结肠癌细胞的生长，促进其凋亡，并呈剂量依赖性。EGCG处理的结肠癌细胞能以剂量依赖性的方式下调磷酸化的Stat3蛋白的表达。因此我们认为EGCG是一种治疗结肠癌的新方法。
[0007]本发明主要解决的技术问题是提供了一种信号传导系统抑制剂化合物在制备治疗结肠癌药物方面的应用。 【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1是EGCG呈剂量依赖性抑制结肠癌HCT-116细胞的生长。经不同浓度的EGCG处理48h后，HCT-116细胞生长受到不同程度的抑制。> IOym时，随着药物浓度的增加，抑制率逐渐降低；< IOym时，随药物浓度的增加，抑制率逐渐增高，呈现剂量依赖性关系。工作浓度为 10、20、40、80、160、320μmol/L的EGCG处理HCT-116细胞48h后，IOym 的 EGCG对细胞的生长有促进作用，其他浓度的抑制率分别为28.02% ±4.86%、19.34% ±32.97%、76.64% ±21.92%、91.67% ±4.29%,88.37% ±3.52%。
[0009]图2是流式细胞仪测定不同浓度EGCG对细胞凋亡的影响。细胞在培养瓶中贴壁生长，呈多角形，在EGCG作用下，它们生长速度减慢，形态发生改变，部分细胞变圆，脱壁。用 40,80,160,320 μ mol/L EGCG 处理作用 48h 后，其凋亡率分别为 0.8%,3.3%,6.1%,44.1 %呈现浓度依赖性。
[0010]图3是用20、40、80、160μmol/L不同浓度的EGCG处理HCT-116细胞24h后，细胞裂解并提取总RNA，然后合成cDNA并在PCR仪中进行扩增，将扩增好的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。随着EGCG浓度的增加，癌基因的表达量呈减少趋势，呈现剂量依赖性关系。
【具体实施方式】
[0011]为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
[0012]实施例1:MTT法测定EGCG对BEL-7402细胞增殖的影响
[0013]设对照组和加用EGCG组(10、20、40、80、160、320Hmol/LEGCG)，取对数生长期细胞，常规胰酶消化后用含10%胎牛血清DMEM培养液制成单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔100 μ L (含约5*103个细胞)，待细胞贴壁后去培养液并加药，每组设3个复孔，另设3个调零孔(不加细胞，只加100 μ L培养液)，继续培养48h。吸掉培养基并用PBS 150 μ L洗2遍，然后每孔加入MTT 10 μ L，4h后终止培养，弃上清液，每孔加入150 μ L的溶解液，置水平摇床上震荡lOmin，在酶标仪(Tecan F200)上测490nm波长的吸光度(OD)值。IOym的EGCG对细胞的生长有促进作用，为26.21% ±46.99% ;20、40、80、160、320 μ M的EGCG对细胞的生长抑制率分别为 28.02% ±4.86%、19.34% ±32.97%、76.64% ±21.92%、91.67% ±4.29%,88.37% ±3.52%。(*Ρ < 0.05)
[0014]实施例2:流式细胞仪检测EGCG诱导HCT-116细胞凋亡
[0015]取对数生长期细胞，常规胰酶消化后用含10%胎牛血清DMEM培
[0016]养液制成单细胞悬液，计数后种于六孔板中，每孔约含2 * IO5个细胞，待细胞贴壁后去培养液并加药，分别加入2mL合有0、40、80、160、320pmol/L EGCG培养液，培养48h后，用不含EDTA的胰酶消化离心收集细胞，用冷的PBS洗涤细胞两次。然后用400 μ LIXAnnexin V结合悬浮细胞,在细胞悬液中加入5 μ L Annexin V-FITC染色液,轻轻混匀后避光孵育15min，加入10 μ L PI染色液避光孵育5min，在Ih内用流式细胞仪(Accuri C6)检测。
[0017]实施例3 =PCR技术检测EGCG对HCT-116的易感基因的抑制作用取对数生长期细胞，常规胰酶消化后用含10%胎牛血清DM EM培养液制成单细胞悬液，计数后种于六孔板中，每孔约含2*105个细胞，待细胞贴壁后去培养液并加药。分别加入2mL合有20、40、80、160 μ mol/LEGCG培养液，培养48h后，用不合EDTA的胰酶消化离心收集细胞，用冷的PBS洗涤细胞两次。收集HCT-116细胞，裂解后提取总RNA，经试剂盒反转录合成cDNA后经PCR扩增。使用分光光度仪测量扩增好的RNA，取2 μ g总RNA进行琼脂糖凝胶电泳
[0018]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的【技术领域】，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【权利要求】
1.下列化学式的信号传导系统抑制剂化合物一表没食子儿茶素没食子酸酯在制备治疗结肠癌药物方面的应用:
【文档编号】A61P35/00GK103830225SQ201210490527
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月27日 优先权日:2012年11月27日
【发明者】徐学军, 魏洁麟 申请人:上海曼克尔瑞生物医药技术有限公司