一种治疗结肠癌的药物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种药物，具体涉及一种用川芎乙醇提取物制成的药物。川芎乙醇提取物是将川芎粉碎成粉末状后加入乙醇回流提取，冷冻干燥后粉碎所得的粉末状固体。本发明的作用是：所得药物能够治疗结肠癌。
【专利说明】
一种治疗结肠癌的药物
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种用于治疗结肠癌的药物，更具体涉及 一种用川芎乙醇提取物制成的药物。
【背景技术】
[0002] 结肠癌(colon cancer)是临床上常见的一种恶性消化系统肿瘤。在我国战国时期 就已经有关于结肠癌的记载。近年来，结肠癌的发病率和致死率在全球范围均呈上升趋势。 因此，结肠癌的治疗在医学研究中非常重要。恶性肿瘤由于病因复杂和有侵袭性等原因，因 此一旦被确诊，通常会很难彻底清除。但是，肿瘤不是在短期形成的，在肿瘤形成这一漫长 过程中，利用药物进行有关干预是可行的。因此，寻找纯天然中草药植物阻止有癌变风险的 细胞进一步发展成癌细胞，可以使很多高危人群远离癌症。结肠癌的治疗手段主要有手术 治疗、放射治疗、化学治疗、生物治疗及中医药治疗等，但手术治疗及放化疗所引发的副作 用是不容忽视的。中医认为结肠癌是由机体正气不足、湿毒内结凝滞而致病，因此，在纯天 然中草药植物中寻找有效且副作用小的抗肿瘤药物的相关研究，已成为国内外十分重要且 有前景的课题。
[0003] 川芎是中医治疗中常用的活血化瘀药物。在《中国药典》(2010年版）的记载中，已 有151个成方制剂中把川芎作为药材之一，占所载录的1640个中成药总数的9.21%。中药川 考来源于伞形科藁本属植物川；(Ligusticum chuanxiong Hort)的干燥根莖，主要产于四 川、贵州、云南等地，其中以四川产者质优，为四川的道地药材。在夏季时，当川芎植株茎上 的节盘突出显著，并略带紫色时采挖，之后经除去泥沙，晒后烘干，去须根等工序，即得到川 芎药材。再经洗净、润透、切片、干燥，可以得到中药饮片。中医认为川考其味辛微苦、药性温 和，归于肝、胆、心包经。川考活血化瘀、开郁行气、疏风止痛，可治疗月经不调、经闭痛经、胸 胁疼痛、头痛眩晕、跌打损伤等症。川芎有效成分的提取方法主要有传统提取法、溶剂提取 法和超临界萃取法等。传统提取法主要有水煎法、回馏法、蒸馏法、渗漉法等，其操作简便， 对工艺、设备的要求不高，但它们存在提取时间长、耗能大、含杂质多等缺点。超临界萃取等 现代提取和分离技术虽然提取物的纯度高、环保节能，但是由于超临界萃取使用的是新技 术新设备，目前局限性也比较大，还难以应用于川芎有效成分的工业化大规模生产。经检索 发现，乙醇和乙醚是川芎提取有效成分的的常用溶剂，而乙醇因对有效成分的提取较完全 而更为常用，是效果较佳的溶剂。因此本发明采取的提取川芎有效成分的方法为乙醇提取 法（以下简称醇提法）。川芎主要的化学成分有阿魏酸、川考嗪、蒿本内酯、川考内酯等。其主 要的活性成分为阿魏酸和川芎嗪;主要的挥发油类物质为蒿本内酯、川芎内酯、川芎酚等； 主要的酸性成分为阿魏酸、大黄酚、瑟丹酸等;主要的生物碱类为川芎嗪、黑麦草碱、L-β-丙 烯酸乙酯-7-醛基咔啉等。据有关研究发现，川芎具有一定的抗氧化作用。其中，生物碱类 和酚酸类是活血祛瘀的主要活性成分;阿魏酸能抑制血小板的聚集，促进血小板的解聚和 抗血栓的形成，解除血管平滑肌的痉挛，抗氧化等。国内外学者在川芎的栽培、加工炮制、化 学成分、药理作用以及临床应用等方面进行了相当广泛的研究。
[0004] 体外细胞培养在生物工程研究中占有着不可动摇的地位，可作为代替模型用于药 理和环境毒理学的研究。体外研究的优点在于可以减少实验动物的用量、节约实验时间、排 除体内其他因素的干扰，同时也可进行多种药物的药理试验。实验室常用来做研究的结肠 癌细胞系有HCT116，HCT8，HT29，LS174T，L0V0，SW480，SW620等。徐修礼等研究发现川芎素能 够在一定程度上抑制moser大肠癌细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，并且具有可以增强化疗 药物作用的功能。韩娇艳研究发现使用不同浓度的盐酸川芎嗪刺激人前列腺癌PC-3细胞与 人结肠直肠癌HCT-116细胞后，发现PC-3细胞与HCT-116细胞增殖明显受到抑制(p〈0.05)。 房良华研究发现主要成分为川芎内酯，毛蕊异黄酮葡萄糖苷，芒柄花苷洋，毛蕊异黄酮，芒 柄花黄素，黄芪甲苷，藁本内酯等的透脓散提取液可抑制人结肠癌L0V0细胞的增殖，诱导细 胞凋亡，阻滞细胞停滞在G1期。但暂未发现使用川芎对HT29结肠癌细胞做相关研究的报道。 根据川芎活血化瘀、开郁行气、疏风止痛的特征，本发明以HT29结肠癌细胞系作为模型，使 用不同浓度的川芎醇提物培养HT29细胞进行实验，通过细胞增殖实验、细胞凋亡、细胞迀移 等相关实验。结果表明，不使用药物时，HT29结肠癌的细胞存活率为93.59%，凋亡率为 1.03%，用200yg/mL川芎醇提物作用于HT29结肠癌的效果是细胞存活率为63.42%，凋亡率为 13.27%，结肠癌细胞的迀移能力显著降低，则这种药物组合效果显著，从而验证其有抑制结 肠癌的效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种药物。
[0006] 本发明中的药物为川芎醇提物。
[0007] 作为优选，所述川芎醇提物为将川芎粉碎成粉末状后加入乙醇回流提取，冷冻干 燥后粉碎所得的粉末状固体，其终浓度为200yg/mL。
[0008] 本发明中的药物可制备用于治疗肿瘤的药物。
[0009] 本发明所述的肿瘤为结肠癌。
[0010] 本发明的有益效果在于：（1)获得的药物可抑制结肠癌细胞的增殖、促进其凋亡、 抑制其转移；（2)采用该方法安全可控，并且便于操作、保管、贮存和运输。
[0011]
【具体实施方式】： 为使本领域技术人员详细了解本发明的生产工艺和技术效果，下面以具体的生产实例 来进一步介绍本发明的应用和技术效果。
[0012] 实施例1川芎提取物的制备 首先称取适量川芎药材并将其粉碎成粉末状，然后加入药材重量10倍量的80%乙醇，加 热回流提取2次，每次30分钟，合并提取液后，经过200目筛网过滤并且蒸馏浓缩得到膏体， 再经冷冻干燥后粉碎即得川芎乙醇提取物。
[0013] 实施例2不同浓度川芎醇提物孵育HT29结肠癌细胞 将HT29结肠癌细胞解冻复苏后加入含有15%胎牛血清(FCS)的DMEM培养基制成细胞悬 液，分种于培养瓶中并置于5% C02,饱和湿度，37°C培养箱中培养。正常培养时约每天更换1 次培养液，等到细胞生长融合度达到70%_80%时进行传代培养;传代培养时首先弃去培养瓶 中的旧培养液，加入37 °C磷酸缓冲盐溶液（PBS)洗瓶2次，在25 cm2培养瓶中加入2mL约 0.25%的胰蛋白酶进行消化。然后在倒置显微镜下仔细随时观察，当发现细胞质回缩、细胞 间隙变大时终止消化。接下来弃去胰酶溶液，加入含15%血清的DMEM培养基，之后用吸管轻 柔吹打使贴壁细胞悬浮。紧接着将含悬浮细胞的培养液转移至10mL离心管中，1500r离心 5min，弃上清液。将细胞重新悬浮于5mL含15%血清的完全培养基中。细胞计数结束，选择合 适浓度将细胞分装到新的无菌培养瓶进行培养，6h后可见细胞贴壁，以后每2-3天换液次， 待细胞长滿瓶底70%_80%后再次消化传代。
[0014] 取4-6代的生长良好，融合度约为60%-70%的细胞进行细胞实验。呈亚融合状态的 细胞，轻柔吹打配成单细胞悬液并接种于96孔培养板，24孔培养板以及Tranwel 1小室铺板， 具体分组情况如下： ① 空白对照组 空白对照组:用无血清DMEM培养液孵育细胞24 h; ② 处理组(共设3组）： 每组加入不同终浓度（100，200，300yg/mL)的川芎醇提物孵育细胞24 h。
[0015]实施例3 MTT方法检测川芎醇提物对HT29结肠癌细胞增殖活性的作用 MTT分析法是一种检测细胞存活和生长的常用方法，以活细胞代谢物还原剂3-(4,5_ dimethylthiazol_2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide assay (MTT)噻唑蓝为基 础。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性的MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲臜 (formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，因此formazan结晶的生成量仅与活细胞 数目成正比。二甲基亚砜(DMS0)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测 定其吸光值(0D值），可间接反应活细胞数目。 实验中MTT溶液的配置配置方法为称取250mg MTT并放入小烧杯中，然后加入50mL PBS (0.01111〇1凡4!17.4)后使用电磁力搅拌机搅拌3〇111；[11保证其充分溶解。最后用直径为0.224111 的微孔过滤器经除菌，分装后，在4°C保存，并在两周内使用完毕。 取实施例2的96孔培养板药物孵育72h后的细胞，每孔加入20yL的MTT溶液后再培养4h， 离心去培养液。每孔加入150yL二甲基亚砜，震荡lOmin使之充分溶解，在酶联免疫检测仪 上选择在波长490nm测定吸光值(A值），比色时空白孔调零，测定各孔光吸收值(0D值），实验 至少重复三次。记录结果，计算存活率。
[0016] 细胞存活率(％)=处理组平均0D值/对照组平均0D值X 100%。
[0017] 表1 MTT法检测HT29结肠癌细胞存活率
*表示与空白对照组比较差异显著(P〈〇.05) 由表1可知，100yg/mL，200yg/mL和300yg/mL川芎醇提物组的细胞存活率分别是 86.65%，63.42%，63.39%;在使用200yg/mL川芎醇提物浓度时，细胞的存活率较100yg/mL药 物处理组明显降低，降至63.42%，而其后随着浓度的增加，细胞存活率的下降趋势又趋于平 缓，300yg/mL药物处理组细胞存活率为63.39%，与200yg/mL处理组无统计学差异，因此200μ g/mL药物处理组是抑制细胞增殖活性的较佳剂量组。
[0018] 实施例4流式细胞术检测细胞凋亡 分别取实施例2的24孔板细胞经药物作用24h后使用0.25%胰蛋白酶消化、离心，弃掉 上清液并用冷PBS洗两次，70%乙醇固定细胞24h。上机测定之前经离心去乙醇，使用PBS洗两 次，加 lOOyg/mL核糖核酸酶（RNase)消化30min(37°C )。在使用碘化丙锭（propidium 1〇虹(16，？1)5(^8/11^染色3〇1^11，并且经尼龙网过滤后，用?403了41^&1让1^型流式细胞仪 (Becton Dickinson，CA，USA)测定。实验结果经计算机软件ModFit LT3.0分析软件分析细 胞周期细胞数，每组实验至少重复3次。
[0019] 表格2不同浓度川芎醇提物作用24h后HT29结肠癌细胞周期及凋亡率的变化
*表示与空白对照组比较差异显著(P〈〇.05) 结果表明（见表2)，100,200,30(^8/1^川芎醇提物浓度作用2411后，细胞周期产生了明 显的变化，尤其是200yg/mL的川芎醇提物与HT29结肠癌细胞作用24h后，细胞周期中S期的 细胞显著增加，G2/M期比例为7.21%。空白对照组结肠癌细胞凋亡率为1.03%，加入10(^8/1^ 川芎醇提物后，细胞凋亡率达到10.67%，川芎醇提物浓度增加至200yg/mL时凋亡率明显升 高到13.27%。而当川芎醇提物浓度增加到300yg/mL后凋亡率为13.97%，上升趋势趋于平缓， 与200yg/mL处理组无统计学差异，可见200yg/mL处理组是川芎促使细胞凋亡的的较佳剂量 组。
[0020] 实施例5 Transwell侵袭实验检测药物对细胞侵袭能力的影响 细胞迀移实验是将Transwe 11小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称下室， 上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的肿瘤细胞种在上室内，下室加入含FBS或某些特 定的趋化因子的培养液，由于聚碳酸酯膜具有通透性，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迀 移，计数进入下室的细胞数量就能反应细胞的迀移能力。
[0021] ①将药物加入Transwell小室中，与HT29结肠癌细胞共孵育，细胞的终浓度大小约 5Xl〇MVmL; ②24孔板的下室内加入500 yL的含20%胎牛血清的DMEM，在Transwel 1小室内加入100 yL的细胞悬液，常规培养24 h; ③ 24 h细胞培养完成后，轻提Transwell小室，倾倒室内的培养基，用适量的PBS将细胞 洗涤2遍，使用4%的多聚甲醛固定细胞15 min，PBS再清洗3次，每次5 min，再使用0.1%的结 晶紫染色细胞30 min，用roS洗涤3次，每次5 min，使用超纯水轻轻冲洗湿润小室表面的细 胞，最后用湿润棉签轻轻擦去未迀移过膜的细胞，风机风干； ④ 倒置Transwell小室，显微镜进行观察和拍照。于显微镜下随机选取5个视野观察细 胞，并计数迀移细胞数。
[0022]结果表明，川芎醇提物浓度为200yg/mL时HT29结肠癌细胞相对对照组的迀移能力 显著降低(见附图1)。
[0023] 尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的 描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的 多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
【附图说明】
[0024]下面结合附图和实施例对本发明作进一步产明。
[0025] 图1 Transwell细胞迀移检测细胞迀移能力 注：1，空白对照组;2，100yg/mL川芎醇提物组;3，200yg/mL川芎醇提物组;4，300yg/mL 川芎醇提物组。
【主权项】
1. 一种药物，其特征在于:所述药物为川芎乙醇提取物。2. 根据权利要求1所述的药物，其特征在于:所述川芎乙醇提取物为将川芎粉碎成粉末 状后加入乙醇回流提取，冷冻干燥后粉碎所得的粉末状固体，其终浓度为200yg/mL。3. 根据权利要求1所述的药物，其特征在于:利用所述药物用于治疗肿瘤的药物。4. 根据权利要求3所述的治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述的肿瘤为结肠癌。
【文档编号】A61P35/00GK105832786SQ201610412924
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】孔晶, 周亚楠, 钱国庆, 许璐
【申请人】淮阴工学院