贝母素甲用于制备新型免疫抑制剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及贝母素甲的新用途，尤其涉及贝母素甲用于制备新型免疫抑制剂的应 用。
【背景技术】
[0002] T淋巴细胞亚型参与免疫应答的各个阶段，在免疫调节中发挥关键作用，当免疫调 控紊乱以及免疫平衡调节机制破坏时将会导致自身免疫疾病的发生。自身免疫性疾病主要 包括硬皮病、系统性红斑狼疮、血清病、类风湿性关节炎等，其发生的原因是由于对自己或 非己识别的控制机制出现了问题，使得一些自身反应性T细胞能够逃避克隆清除，识别自 身的外周组织抗原并且引起自身免疫反应。通过调节T淋巴细胞膜离子通道功能来改变T 细胞的活性，可达到治疗自身免疫疾病的目的。目前，传统治疗自身免疫疾病的方法均以免 疫抑制为主，主要以遏制自身反应性淋巴细胞的增殖为目的，非特异性免疫抑制剂的应用 以及特异地应用免疫耐受T细胞的疫苗会对整个免疫系统进行抑制，其结果往往导致疫苗 等毒性累积而出现严重副作用，同时会不同程度地影响机体正常免疫反应而降低机体对感 染和肿瘤等免疫作用。
[0003] 钾通道在T淋巴细胞的活化中起重要作用，T淋巴细胞活化的关键磷酸酶是钙依 赖的神经钙蛋白磷酸酶，其中与T淋巴细胞关系最为密切的钾离子通道是：电压门控钾通 道Kvl. 3和钙激活依赖的钾通道KCa3. 1 (也称IKCal，KCNN4，hKCa4)。因此能选择性抑 制电压门控钾通道Kvl. 3或钙激活依赖的钾通道KCa3. 1，都会影响T淋巴细胞的功能。
[0004]Kvl. 3钾离子通道是人类T淋巴细胞上表达最丰富、生理功能最重要的一类电压 依赖型钾离子通道（PANYIG，2005JASONRetal，2010)，在T淋巴细胞的活化、增殖、分 化以及免疫功能调节中具有重要的作用，其表达数量与T细胞亚型、细胞分化状态和细胞 活化状态有关。Kvl. 3和11(&1共同为持续的钙内流提供必需的阳离子流出平衡，T细胞活 化需要通过钙释放的钙通道从外部环境持续输入钙离子，钙离子内流使膜去极化。Kvl. 3的 开放适应膜的去极化和维持膜的静息电位，而IKCal开放则增加胞质钙和使膜电位超极化。 Kvl. 3是人类静息T细胞钙信号的基本调节器。
[0005] 钾通道在T淋巴细胞的活化中起重要作用，开放通道增加跨膜电位负值，这就反 过来通过钙释放活化的钙通道增加钙内流，进一步导致钙依赖的神经钙蛋白磷酸酶活化， 后者是T淋巴细胞活化的关键磷酸酶。增加表达的钾通道能明显使活化的T淋巴细胞超极 化，加速的钙内流保证了高水平的胞内钙离子，后者是T淋巴细胞充分活化和产生细胞因 子所必须的。相应的，钾通道阻滞剂使T淋巴细胞保持负性膜电位和长效钙信号的能力降 低。CD8+细胞分为三个主要的亚群，分别是幼稚细胞、中心记忆细胞和效应记忆细胞。静息 的人类T淋巴细胞表达Kvl. 3约300~400个/细胞，11(&1约8~10个/细胞，阻滞静息 T细胞上的Kvl. 3能使膜电位从-50mV升到-30mV。静息状态，幼稚的中心记忆细胞（TCM) 和表达⑶4及⑶8的TCM都表达过多的Kv1. 3 (约200~300个/细胞），而IKCal仅仅表 达8~20个/细胞。幼稚的效应细胞和TCM在抗原或丝裂原刺激后表达相似数量的两种 通道（(Kvl. 3约400~500个/细胞，11(&1约200~500个/细胞）。而抗原或丝裂原刺 激的CD4+和CD8+TEM，Kvl. 3表达增加至1500个/细胞，远多于KCal的表达（约10个/ 细胞）。在人类的T淋巴细胞中，11(&1和Kvl. 3在T淋巴细胞的分化以及抗原介导的免疫反 应如细胞因子白细胞介素（IL)_2,肿瘤坏死因子（TNF)-A，干扰素（IFN)-C中起调节作用。
[0006] 因此，针对T淋巴细胞上的Kvl. 3和11(&1的钾通道阻滞剂对抑制T淋巴 细胞增殖分化成为研宄的重点。早期研宄发现广谱钾离子通道阻滞剂4-氨基吡啶 (4-Aminopyridine，4-AP)能改善MS(多发性硬化症）患者症状，但是由于其广谱阻断效应， 副作用多，限制了它的应用，因此以Kvl. 3和IKCal为靶点筛选出高选择性的钾离子通道阻 滞剂成为研宄的热点。
[0007] 膜片钳技术是用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆以 上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上 分隔，在此基础上固定点位，对此膜片上的离子通道的离子电流（PA级）进行监测记录的方 法。目前广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医 药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研宄。
[0008] 本发明旨在利用膜片钳技术研宄贝母素甲免疫抑制的作用机制。通过在通道电流 记录中，分别于不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物，研宄它们对不同 电压门控钾通道功能的可能影响，其确定其是否对Kvl. 3钾通道作用有选择性阻滞作用。
[0009] 贝母素甲的概况
[0010] (1)贝母素甲（浙贝母碱）是从贝母类药材中提取的一种生物碱，英文名称： 卩611^116 ;贝母素甲的分子式为0271145勵3、分子量为431.6511，结构式如下：
[0012] (2)贝母素甲广泛存在于贝母类植物中。川贝母、浙贝母、伊贝母、平贝母和瓦布 贝母都已被《中国药典》收录，药典规定含贝母素甲（C27H45N03)和贝母素乙（C27H43N03)的总 量，不得少于〇. 080%。贝母来源于百合科贝母属多种植物的鳞茎，具有清热润肺，化痰止 咳之功效。贝母中的生物碱种类多，是贝母止咳、化痰作用的有效成分。贝母为多年生草本 植物，叶子长形，似韭，花黄绿色，下垂像钟，其鳞茎供药用，有止咳化痰、清热散结之功，产 于四川、云南、甘肃、新疆等地。贝母为名贵药材，堪称药中之宝。新中国成立后曾列为国家 计划管理品种，1980年以后改为市场调节产销产品。40年来，贝母的生产有较大的发展，年 产量由20世纪50年代初的40多吨发展到2000年的2000吨左右，2014年产量估算接近 4000吨，产值接近70000万元，具备较大的市场供应能力及开发潜力。
[0013] (3)贝母素甲的提取与纯化方法：
[0014] 贝母素甲的提取方法大致有3类，一是传统的摇床浸提法，为了提高生物碱的提 取率，人们还辅助添加了微波法和超声法；二是渗漉法，可用不同浓度的盐酸进行提取；三 是醇提法，常用80% -95%的甲醇或乙醇进行提取，人们还在醇提工艺前使用纤维素酶预 处理，降解细胞壁中的纤维素，促进有效成分溶出，提高提取率。
[0015] 常用的纯化方法有：大孔树脂纯化法和萃取纯化法两种。
【发明内容】
[0016] 本发明的第一个目的是提供贝母素甲在制备用于选择性抑制Kvl. 3离子通道的 药物中的应用。本发明的第二个目的是提供一种新型免疫抑制剂。
[0017] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0018] 式（I)所示贝母类化合物或其药物学上可接受的盐在制备新型免疫抑制剂的应 用；所述的新型免疫抑制剂的作用机制主要通过选择性抑制Kvl. 3钾离子通道；
[0020] 作为优选，所述的免疫抑制剂预防和/或治疗的自身免疫疾病包括器官特异性自 身免疫病和系统性自身免疫病；器官特异性自身免疫病中组织器官的病理损害和功能障碍 仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官。
[0021] 作为优选，器官特异性自身免疫病包括慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰 岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血 肾炎综合征（goodpasturesyndrome)、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发 性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
[0022] 作为优选，系统性自身免疫病包括硬皮病、红斑狼疮、类风湿性关节炎和结节性多 动脉炎。
[0023] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0024] -种新型免疫抑制剂，它的有效成分为上述的贝母类化合物或其药物学上可接受 的盐，其作用机制主要通过选择性抑制Kvl. 3钾离子通道。
[0025] 作为优选，所述的免疫抑制剂预防和/或治疗的自身免疫疾病包括器官特异性自 身免疫病和系统性自身免疫病；器官特异性自身免疫病中组织器官的病理损害和功能障碍 仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官。
[0026] 作为优选，器官特异性自身免疫病包括慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰 岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血 肾炎综合征（goodpasturesyndrome)、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、多发 性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎。
[0027] 作为优选，系统性自身免疫病包括硬皮病、红斑狼疮、类风湿性关节炎和结节性多 动脉炎。
[0028] 本发明的有益技术效果：经过贝母素甲对Kvl. 2-Kvl. 8离子通道抑制作用的试 验，发现贝母素甲能与Kvl. 3通道有较强选择性结合，从而降低过度兴奋的T淋巴细胞，减 弱对于T淋巴细胞的活化，从而降低T细胞活性，最终降低细胞免疫，而对其它钾离子通道 作用很弱。由于贝母素甲是选择性通过抑制Kvl. 3离子通道，可以降低如硬皮病，红斑狼疮 等免疫系统功能亢进疾病治疗所引起的不良反应而不影响正常的免疫功能，因此这一类新 药的开发具有重大意义。
【附图说明】
[0029] 附图1贝母素甲对Kvl. 3离子通道的抑制作用；
[0030]A不同浓度贝母素甲对Kvl. 3离子通道电流的影响；B贝母素甲对Kvl. 3峰值电流 的量效曲线；采用Hill方程式得出其50%抑制浓度（IC5Q)为354. 4yM(n= 6);
[0031]CKvl. 3电流激活后的150ms处出现对电流使用依赖性量效曲线；数据符合Hill 方程，50 %使用依赖性抑制浓度（use-dependentIC5(I)为 142. 1yM(n= 6)。
[0032] 附图2贝母素甲对Kvl. 2离子通道的end-pulse(稳态后的）电流的抑制百分率；