专利名称：：一种可用作免疫抑制剂的带有-Ile-Sta-Sta-Tyr-残基片段的环肽及其合成工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肽化合物，具体是一种带有-Ile-Sta-Sta-Tyr-残基片段的环肽及合成工艺。
背景技术：
：Hymenistatin-l(HS-1)是由Pettit等研究者从太平洋hymeniacidon海绵中分离得到的一种环八肽(PettitG.R.，ClewlowRW.，DufresneC.，etal.IsolationandstructureofthecyclicpeptidehymenistatinI.Can.J.Chem.1990,68:708-711.)。月太链序列为cyclo(Pro-Pro-Tyr-Val-Pro-Leu-Ile-Ile)。为了论述方便和准确，给氨基酸残基以编号，即HS-l表达为(11ei-Ile2-Pro3-Pro4-Tyr5-Val6國Pro7-Leu8)。有报道称HS-1在小鼠成淋巴细胞非白血性白血病的P388的研究中，具有抑制细胞生长的作用，但结果并没有在后续的研究中得到充分证实。Siemion等研究者揭示了HS-l具有某些抑制体液和细胞免疫反应的免疫抑制作用。文献(PoojaryB，BelagaliSL.Syntheticstudiesoncyclicoctapeptides:Yu皿aninFandHymenistatin.Eur.J.Med.Chem.2005，40(4):407-412.)中合成的HS-l显示处对细菌生长的抑制作用，但对真菌的抑制作用不强，HS-l的驱虫作用不大，但表现出一定的抗炎症作用。文献(PawelZubrzak，KarolKociolek，MarekSmoluch,etal.SearchfornewsyntheticimmunosuppressantsII.Tetrazoleanaloguesofhymenistatinn1.ActaBiochimicaPolonica,2001,48:1151-1154.)中，作者用1，5-二取代四唑环修饰HS-1之后，对HS-1的免疫抑制活性影响不是很大。HS-l的一个基本特征是在分别溶于CHC13和Me2SO后，化合物的Pro、Pr^残基之间是一个顺式酰胺键，在Ile2-Tyr5区域有一个卩VIa转角，以及在Val6-lie1区域有一个卩I或卩II转角。天然结构的HS-1中的氨基酸残基都是疏水性氨基酸，加之序列富有Pro具有二级胺的环状结构，这使得化学合成极为困难，也非常不利于纯化。
发明内容本发明需要解决的技术问题是，设计最佳的合成与纯化路线，获得产率高、纯度高的可用作免疫抑制剂的带有-Ile-Sta-Sta-Tyr-残基片段的环肽化合物，且该环肽化合物的免疫抑制活性更高。为了评价肽键Ile2-Pro3，Pro3-Pro4，Val6-Pro7对于HS-1的生物活性有何影响，申请人用Statine、Statine"代替ProLPro4，合成出一个新的环化的HS-1的类似物。申请人还希望通过这种修饰策略进而降低该类似物疏水性，提高其在水溶液中的溶解性，以利于随后的活性检测和未来临床上的应用。Statine(3S，4S)是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA，胆固醇合成限速酶)的竞争性抑制剂，具有多种免疫调节作用和细胞效应，且不依赖于血液胆固醇的降低。近来有研究表明，Statine不但可以抑制IFN-Y刺激诱导的人巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的MHC-II抗原的表达，而且可以选择性阻断整合素(32、白细胞功能抗原-1(LFA-l,gpCDlla/CD18)的表达。这些功能与Statine对HMG-CoA的抑制作用无关。提示Statine也是一种潜在的免疫抑制齐[J。由于天然的Hymenistatin-l显示出较弱的生物学活性，这就妨碍了其作为免疫抑制剂的应用。因此，本发明就是采用Statine来对HS-l进行修饰，以期能够有效提高HS-1的免疫抑制活性。本发明中所提到的氨基酸可以是D-型氨基酸也可以是L-型氨基酸，作为优选，本发明所用的氨基酸为L-型氨基酸。本发明可用作免疫抑制剂的带有-Ile-Sta-Sta-Tyr-残基片段的环肽，环(Ile-Ile-Sta-Pro-Tyr-Val-Pro-Leu)(简称A4HS1)，其结构式为上述环肽的理化特性是，白色粉末，难溶于水，易溶于乙醇，DMSO等有机溶剂。一般认为，直链肽在体外往往具有很好的生物活性与稳定性，但进入体内后活性往往会很快消失，这是直链肽作为多肽药物的不利方面。于是，人们试图将直链肽改造为环肽，利用环肽的具有固定构象的特点，使其能更好地与受体结合，提高生物活性、延长半衰期、增加受体选择性；而且由于环肽的分子内不存在游离的氨基端和羧基端，使得环肽对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大为降低。一般来讲，环肽的代谢稳定性和生物利用度要远高于直链肽。但是环肽的化学合成往往十分困难，尤其是首尾相连的环肽合成难度最大，因为环肽的前体即直链肽的肽键具有很强的P键特征，分子更易于形成反式构象，呈舒展状态，造成属于反应中心的端基的羧基和氨基在空间上距离较远，不利于发生分子内縮合反应，而是有利于分子间縮合。本发明合成的四种新的多肽都是杂聚肽都是首尾相接的环肽，这些肽都具有二级胺的Pro，而且都是具有疏水作用极强的特点，因此合成难度很大。本发明所研究的肽链中，8个氨基酸残基都是疏水性氨基酸，这不但造成合成的困难，也使得纯化过程更加不易。因为这些环肽不溶于水溶液，因此在纯化中，必须溶于非水溶剂中，或特殊的缓冲液，而这些溶剂或缓冲液很可能不适合应用于生物实验系统。另外常规的固相合成中需要特殊的固相支持物。在用普通的固相支持物时，在二肽阶段，由于环化引起的损失非常高。有些情况甚至导致所有肽链从固相支持物上损失，但是若C端为氨基化Pro时，使用CTC树脂则可以避免二肽"切断"副反应从而会能使产量大为提高。多肽再液相情况下"首尾"偶联的另一重要因素是避免消旋反应。从合成的角度，Statine(简称为Sta)的引入具有两方面的考虑Sta不易引起消旋；其次Sta在N-端时，线性多肽较易纯化。围绕这些考虑，因此本发明中所采用的几种不同的树脂，即分别为Fmoc-法WangResin和CTCResin，及Boc法MerrifieldResin。其次，本发明以BOP/HoBt/DIEA作为新型的复合型縮合试剂，具有反应快速，縮合条件温和以及产物易于纯化等特点，可以达到提高产物得率，降低纯化费用的目的。对于环化过程非常容易引起消旋的环节，申请人同时采取了縮短反应时间、多位点接肽反应等一系列手段来抑制消旋，结果令人满意。另外值得一提的是，疏水性很强的HS-l经Statine修饰后，溶解性大大增强，溶解度相比于HS-1本身大大提高，这非常有利于对其生物活性的检测和未来临床上的应用。基于以上研究，本发明环肽的合成工艺，其特征在于，1)脱除氨基保护基将Fmoc-AAn-CTCResin或Boc-AAn-MerrifieldResin，用DMF浸泡使之充分溶胀，然后抽干；加入含哌啶的DMF溶液，通氮气反应，再抽干；然后用DMF充分洗涤，以除去残留的脱保护试剂，得到H-AAn-CTCResin或H-AAn-MerrifieldResin;其中AAn选自氨基酸序列Ile、Ile、Sta、Sta、Tyr、Val、Pro、Leu中任一氨基酸，11=18任一正整数；2)接肽反应在反应器中加入溶解有Fmoc-AAn-OH的DMF溶液，通氮气搅拌，然后加入HBTU或HATU，最后加入NMM，反应，得到Fmoc-AAn—1-AAn-CTCResin或Boc-AAn"-AAn-MerrifieldResin;抽干，用DMF充分洗涤，然后用甲醇洗涤树脂，以除去氨基酸溶液和DMF，然后用含哌啶的DMF溶液脱保护，得到H-aan—LaAn-ctcResin或H-aan—1-aan-MerrifiddResin，其中AAn—i为氨基酸AAn前位的氨基酸，依此类推；依氨基酸序列，继续用Fmoc-lie-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Sta-OH，Fmoc画Sta—OH，Fmoc-Tyr(tBiO-OH，Fmoc曙Val-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc國Leu-OH中其余6种重复以上接肽反应，最终合成出所需肽链Pro-Val画Tyr-statine-statine画Ile-Ile-Leu;3)肽链的切割将合成肽链用TFA液进行切割反应，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，高速离心，于真空干燥器中充分干燥，得线性肽链的粗品，再经硅胶柱纯化得线性纯化多肽；4)肽链的环化将线性纯化多肽用DMF溶解，加入一定量的EDC、HOBt和DIEA，反应过程用离子阱质谱仪全程跟踪直至所有的线性肽都转化成环状多肽为止；蒸干DMF，得环肽粗品。后面实施例子的合成工艺中，树脂为Boc-AAn-MerrifieldResin，氨基酸AAn为Pro，AA^为Val。作为优选，所述的肽链的环化步骤后有环肽粗品的纯化步骤将上述环肽粗品溶于DMSO中，用高效液相色谱仪进行分离纯化，色谱柱为C18反相柱，洗脱液A液为0.1。/。TFA的水溶液，B液为含0.1。/。TFA的乙腈水溶液，检测波长为220nm。本发明采用固相法合，用Statine修饰天然结构的HS-l，合成出其类似物A4HS1，经质谱仪分析检测，验证了合成产品的正确性。产品经RP-HPLC纯化，产率高且一次纯化后纯度均达到90%以上。产品理化性质稳定，纯度高，为随后的生物活性检测奠定了基础。图1是合成环肽A4HS1的MS质谱图；图2是合成环肽A4HS1的RP-HPLC图。具体实施例方式下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。1合成部分1.1仪器与试剂多肽合成仪(ABI433，美国ABI公司)、半制备型高效液相色谱仪(WatersDeltaPrep4000，美国Waters公司)、分析型高效液相色谱仪(Agilent1100，美国Agilent公司)、冷冻干燥机(ChristAlpha,德国CHRIST公司)、离子阱质谱仪(LCQDeca，美国Thermo-Finnigan公司)、紫外分光光度计(BeckmanDU7400,美国Beckman公司)、CI8反相分析柱(WatersXTerra,3.5um,125A,4.6xl50mm)。实验所用Boc-Pro-MerrifieldResin(取代值0.22mmol/g,交联度1%,100-200mesh)、BooVal-WangResin(取代值0.52mmol/g,交联度1%,100-200mesh)、Fmoc-Pro-CTCResin(取代值0.25mmol/g，交联度1%,200-400mesh)、Boc-Tyr(tBu)-OH、Boc-Pro國OH、Boc-Ile-OH、Boc-Leu画OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Pro國OH、Fmoc國Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Boc-Statine(3S，4S)-OH、HATU、HBTU、HOBt、BOP、DIEA、TFA、DMF、DMSO、DCM、ACN和苯甲硫醚均购自于杭州中肽，哌啶经重蒸后使用，水为二次去离子水。1.2HS-1的一种类似物A4HS1的合成1.2.1A4HS1的合成工艺与纯化1.2.1.1脱除氨基保护基将Fmoc-Pro-MerrifieldResin8.0g(合成规模为2.0mmol)用DMF浸泡30min，使之充分溶胀，然后抽干。加入含20%哌啶的DMF溶液20mL，通氮气反应30min，再抽干。然后用DMF洗涤5次，以除去残留的脱保护试剂。茚三酮检测，若树脂呈深蓝色，则表明Fmoc保护基已经脱除。得到H-Pro7-MerrifieldResin。1.2丄2接肽反应在反应器中加入溶解有6.6gBoc-Val-OH的DMF溶液，通氮气搅拌几分钟，然后加入HBTU(或HATU)，最后加入NMM，反应30min。得到Boc-Val6-Pro7-MerrifieldResin。加入DMF的量以完全浸没树脂为准。抽干，用DMF洗涤5次。然后用甲醇洗涤树脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便进行茚三酮检测，检测结果若树脂呈现无色，则说明反应较为完全。然后再次用含20%哌啶的DMF溶液脱保护，得到H-Val6-Pro7-MerrifieldResin。按肽链的氨基酸序列依次继续用Boc-Tyr(tBu)-OH、Boc-Sta-OH、Boc-Sta-OH、Boc-Ile~OH、Boc-lie—OH、Boc-Leu-OH重复以上接肽反应，直至最终合成出所需肽链。完整的合成顺序为Pro,Val，Tyr，statine，statine，9lie,Ile，Leu。因statine是用Boc保护，因此在连接statine后，要将肽链片段先从树脂上切割下来，然后脱保护、洗涤、树脂活化，再连下一个残基。1.2.1.3肽链的切割将合成肽链用HF液切割，反应时间为1.2h，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，8000rpm离心10min，于真空干燥器中干燥12h，得线性肽链的粗品，纯度56%。粗品经硅胶柱纯化的粗品纯度92%(得率85%)。1.2丄4肽链的环化将线性纯化多肽0.5g用200rnLDMF溶解，加入一定量的EDC、HOBt和DIEA，反应过程用离子阱质谱仪全程跟踪直至所有的线性肽都转化成环状多肽为止，总时间约30-40分钟。蒸干DMF，得环肽粗品，粗品纯度75%。粗品用离子阱质谱仪进行分析鉴定。1.2丄5环肽粗品的纯化将上述环化粗品肽溶于适量DMSO中，用高效液相色谱仪进行分离纯化，色谱柱为C18反相柱，洗脱液A液为0."/。TFA的水溶液，B液为含O.P/。TFA的乙腈水溶液，检测波长为220nm。纯化好的液体进行冻干得最终环化多肽244mg,纯度90.1%(得率55.6%)。1.2.1.6分析型HPLC检测纯度色谱柱为WatersXTerra反相柱(3.5u,4.6士150mm,125A)，洗脱液A液为0.1%TFA的水溶液，B液为含0."/。TFA的乙腈水溶液，检测波长为220nm。1.2丄7MS鉴定离子阱质谱仪检测目标产物的分子量。1.3合成肽纯化后的色谱分析纯化时以TFA为交换离子对、以含0.1%TFA的乙腈水溶液为洗脱液、采用线性梯度洗脱方式对目标肽进行纯化。纯化后的色谱分析结果显示，主峰面积较大，其它杂质峰面积相比于主峰面积要小得多(图2)，表明合成的粗品经反相高效液相色谱纯化后，目标肽的纯度得到了很大地提高。1.4合成肽纯化后的质谱鉴定ESI-MS分析的结果显示，实际合成的多肽或杂聚肽类似物的实际分子质量与理论分子质量非常吻合。同时也可以看出，主峰明显，杂质很少说明合成的目标肽经色谱仪纯化后，可以得到较纯的目标肽(图1)。表l:合成的A4HS-1的产率、分子量及纯度<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2活性实验部分2.1仪器与试剂生物安全柜(美国FORMA公司)，二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)低温高速离心机(日本KUBOTA公司)，酶联免疫检测仪(中国)，电子分析天平(Mettler-Toledo公司)，塑料培养皿(96、24孑L丹麦Nunc公司)，721分光光度计，CsA，蓖麻油，RPMI-1640培养基(GIBCO公司)，小牛血清(GIBCO公司)，谷氨酰胺,青霉素(华北制药股份有限公司)，链霉素(上海四药有限公司)，CsA(诺华制药有限公司)，DNFB,印度墨汁，等。2.2试验动物BALB/C小鼠，6-8周龄，18-22g，雌雄各半。购自于杭州师范大学实验动物中心。2.3方法2.3.1迟发型超敏反应(DTH)试验小鼠腹部皮肤去毛约3cm2区域,然后用微量进样器取1.2%DNFBC取麻油25ml，丙酮25ml，混匀，加入0.41mlDNFB，约0.6克，溶于上述麻油丙酮混合物中)O.lml，均匀滴加于脱毛区致敏。于致敏当天开始按200ug/mouse，20ug/mouse剂量对小鼠灌胃给药，1次/d,连续7d。末次给药30min后,用1.2%DNFB涂于每鼠右耳前后两面。实验分组情况为空白对照组灌胃40(^10.9%NaCl溶液；阳性对照组灌胃400plCsA(500ug/ml);多肽组每种合成肽分为高(500ug/ml)、低(50ug/ml)两个试验组，灌胃400pl。各组每天灌胃l次，共7天。24h后称体重,颈椎脱臼处死小鼠,分别剪下双耳，用8mm打孔器在相同部位打下圆耳片，电子天平称重,以左、右耳片重量差值作为肿胀度。2.3.2小鼠碳廓清实验空白对照组灌胃40(^10.9。/。NaCl溶液；阳性对照组灌胃400plCsA(500ug/ml);多肽组每种合成肽分为高(500ug/ml)、低(50ug/ml)两个试验组，灌胃400(al。各组每天灌胃l次，共7天。从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(注射用墨汁将印度墨汁原液用生理盐水稀释3-4倍)，按每10g体重0.1mL计算。待墨汁注入，立即计时。末次给药后24小时，鼠尾静脉注射印度墨汁O.lml/10g，于注射墨汁后l分钟及5分钟眶内取血40ul，分别放入含有O.1%Na2C032ml的小试管内，摇匀，用分光光度法测定光密度，按下式计算廓清指数K值。,log,—1ogOD2拉颈处死动物后剪取肝脾称重。吞噬功能以吞噬指数表示。吞噬指数"W^^X^肝重+脾重2.3.3淋巴细胞增殖试验断颈处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于lmL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，调整细胞浓度为3xl(^个/mL。将脾淋巴细胞悬液接种到96孔培养板中，每孔10(Hd，设6个复孔。空白对照组每孔加lOO^llRPMI1640培养基；阳性对照组每孔加10(^1CsA(500ug/ml，用无水乙醇配制成5mg/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱-20。C保存，用时用完全培养液稀释到所需浓度。)；多肽组每种合成肽(以无水乙醇为溶剂，将多肽配制成5mg/ml的溶液；然后用完全培养液稀释到我们所需要的浓度。)分为高(500ug/ml)、低(50ug/ml)两个试验组，每孔加100W。将96孔板置C02培养箱中(5%C02，37°C)培养48h。培养结束后，每孔添加20ulMTT(5ug/ml)，在5%C02，37。C条件下培养4h，离心(1000r/minx5min),吸弃上清，每孔添加二甲亚砜150ul，轻轻震荡10min以溶解紫色结晶沉淀，测定在492nm波长处的光吸收值。将实验组和对照组6个复孔的OD各自取平均值,用下式计算抑制率。抑制率％=[1-试验组O"值]xl00L阴性对照组OD值J2.4统计学分析实验数据用(3f±"表示，各组间比较采用方差分析和t检验。PO.05表示具有显著性差异。2.5结果2.5.1环肽A4HS1的溶解性HS-1通过Sta取代后成为环肽A4HS1，其溶解性大大增强。2.5.2环肽A4HS1对小鼠DTH的影响A4HS1在低浓度时肿胀度和胸腺指数比HS-1高浓度组和低浓度组低，所以说A4HS1对小鼠迟发型超敏反应的抑制作用比HS-1强，与阳性对照组(环孢菌素)对小鼠迟发型超敏反应的抑制作用接近。表l环肽A4HS1对小鼠DTH的影响(3±^"=12)组另u肿胀度胸腺指数脾脏指数阴性对照(0.9%NaCl)0.0300±0.00120細3士0細60.0052±0.0005阳性对照(CsA，500ug/ml)0.0142士0扁lb0扁l士0扁3a0.0037士0.0006aHS-1组(500ug/ml)0.0153士0.0013b0扁l士0扁5a0.0054±0細5HS-1组(50ug/ml)0.0155土0扁4b0細6士0細40扁2土0扁8A4HS1组(500ug/ml)0.0237士0.0017c0.0035士0.0004a0.0055±0.0005A4HS1组(50ug/ml)0.0145土0.0023b0.0031土0扁7a0.0051±0細6a:PO.05,相比于阴性对照组(生理盐水组)；b:PO.Ol，相比于阴性对照组c:P<0.05，相比于阳性对照组(环孢菌素组)。2.2环肽A4HS1对小鬧L巨噬细胞吞噬功能的影响阴性对照组、阳性对照组、HS-1组及A4HS1组的实验结果详见表2。表2环肽A4HS1对小|鼠巨噬细胞吞噬功能的影响(3f±=12)组另ij脾重(g)胸腺重量(g)吞噬指数阴性对照(0.9%NaCl)0.1275±0.01730.131±0.0358.893±1.02阳性对照(CsA，500ug/ml)0.0966士0.0180b0.099士0.019b7.301士0.82aHS-1组(500ug/ml)0.1227±0.01720.113士0.025a8.670±0.97HS-1组(50ug/ml)0.1218±0.05730.124±0.0327.608±0.85A4HS1组(500ug/ml)0.1172±0.01580,104±0.063b9.104±0.49A4腦组(50ug/ml)0.1267±0.02440.129±0.0265.576±0.66ba:PO.05,相比于阴性对照组；b:P<0.01,相比于阴性对照组.结果表明，A4HS1在低浓度时，对小鼠巨噬细胞吞噬能力都表现出明显的抑制作用，且表现出比HS-1更强的抑制作用。甚至超出了阳性对照组。2.3环肽A4HS1对小鼠淋巴细胞增殖的影响利用MTT法测得的环孢菌素(阳性对照)组对小鼠淋巴细胞的抑制率为12.6%，A4HS-1高、低剂量组的抑制率分别为8.6%禾卩14.5%，A4HS-1低剂量组对淋巴细胞增殖的抑制活性比HS-1组高，甚至比阳性对照组也高。数据见表3。表3环肽A4HS1对淋巴细胞增殖的影响(3f±&"=6)i~~^OD值抑制率(100。/。)空白对照0.1727±0.0121----阳性对照(CsA,500ug/ml)0.1510±0.009212.6%HS-1组(500ug/ml)0.1533±0,011411.2%HS-1组(50ug/ml)0.1540土0扁710.8%A4HS1组(500ug/ml)0.1577±0.01168.6%A4HS1组(50ug/ml)0.1477±0.012514.5%a:PO.Ol，相比于阳性对照组(环孢菌素组)。HS-1在高浓度和低浓度时，对淋巴细胞增殖都表现出一定的抑制作用，且高浓度比低浓度的抑制作用略强，但是都比阳性对照组弱，这和以往的研究结果一致；A4HS1类似物在低浓度时，对淋巴细胞增殖的抑制率要比高浓度强，且都比阳性对照组和HS-1组强。3结论通过比较阴性对照组、阳性对照组、HS-1和A4HS1对小鼠迟发型超敏反应的抑制作用、对巨噬细胞吞噬能力的影响以及对淋巴细胞增殖的抑制作用，A4HS1均表现出了比HS-1更强的免疫抑制作用，已经达到或超出了阳性对照(环孢菌素)的免疫抑制作用。可以用来用作免疫抑制剂。权利要求1.一种可用作免疫抑制剂的带有-Ile-Sta-Sta-Tyr-残基片段的环肽，环(Ile-Ile-Sta-Sta-Tyr-Val-Pro-Leu)，其结构式为id="icf0001"file="S2008100610308C00011.gif"wi="149"he="97"top="50"left="38"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、根据权利要求1所述的带有-Ile-Sta-Sta-Tyr-残基片段的环肽，其特征在于为白色粉末，难溶于水，易溶于有机溶剂乙醇，DMSO中。3、一种如权利要求1或2所述的带有-Ile-Sta-Sta-Tyr-残基片段的环肽环肽的合成工艺，其特征在于有如下步骤1)脱除氨基保护基将树脂Fmoc-AAn-CTCResin或Boc-AAn-MerrifieldResin，用DMF浸泡使之充分溶胀，然后抽干；加入含哌啶的DMF溶液，通氮气反应，再抽干；然后用DMF充分洗涤，以除去残留的脱保护试剂，得到H-AAn-CTCResin或H-AAn-MerrifieldResin;其中AAn选自氨基酸序列Ile、Ile、Sta、Sta、Tyr、Val、Pro、Leu中任一氨基酸，n-l8任一正整数；2)接肽反应在反应器中加入溶解有Fmoc-AAn-OH的DMF溶液，通氮气搅拌，然后加入HBTU或HATU，最后加入NMM，反应，得到Fmoc-AAn—1-AAn-CTCResin或BooAAn—^AAn-MerrifieldResin;抽干，用DMF充分洗涤，然后用甲醇洗涤树脂，以除去氨基酸溶液和DMF，然后用含哌啶的DMF溶液脱保护，得到H-AAn—^AAn-CTCResin或H-AAn"-AAn-MerrifieldResin，其中AAn"为氨基酸AAn前位的氨基酸，依此类推；依氨基酸序列，继续用Fmoc-Ile"OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Sta-OH，Fmoc-Sta—OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoe-Pro國OH，Fmoc-Leu-OH中其余6种重复以上接肽反应，最终合成出所需肽链Pro-Val-Tyr-statine-statine画Ile-Ile-Leu;3)肽链的切割将合成肽链用TFA液进行切割反应，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，高速离心，于真空干燥器中充分干燥，得线性肽链的粗品，再经硅胶柱纯化得线性纯化多肽；4)肽链的环化将线性纯化多肽用DMF溶解，加入一定量的EDC、HOBt和DIEA，反应过程用离子阱质谱仪全程跟踪直至所有的线性肽都转化成环状多肽为止；蒸干DMF，得环肽粗品。4、根据权利要求3所述的环肽的合成工艺，其特征在于树脂为Boc-AAn-MerrifieldResin，氨基酸AAn为Pro，AA11'1为Val。5、根据权利要求3所述的环肽合成工艺，其特征在于所述的肽链的环化步骤后有环肽粗品的纯化步骤将上述环肽粗品溶于DMSO中，用高效液相色谱仪进行分离纯化，色谱柱为C18反相柱，洗脱液A液为TFA的水溶液，B液为含TFA的乙腈水溶液，检测波长为220nm。6、根据权利要求4所述的环肽合成工艺，其特征在于所述的肽链的环化步骤后有环肽粗品的纯化步骤将上述环肽粗品溶于DMSO中，用高效液相色谱仪进行分离纯化，色谱柱为C18反相柱，洗脱液A液为TFA的水溶液，B液为含TFA的乙腈水溶液，检测波长为220nm。全文摘要本发明涉及一种可用作免疫抑制剂的带有-Ile-Sta-Sta-Tyr-残基片段的环肽，环(Ile-Ile-Sta-Sta-Tyr-Val-Pro-Leu)。其合成工艺为1)脱除氨基保护基；2)接肽反应；3)肽链的切割；4)肽链的环化。从而获得了产率高、纯度高的可用作免疫抑制剂的带有-Ile-Sta-Sta-Tyr-残基片段的环肽化合物，且该环肽化合物的免疫抑制活性更高。通过A4HS1对小鼠迟发型超敏反应的抑制作用、对巨噬细胞吞噬能力的影响以及对淋巴细胞增殖的抑制作用的实验，可以看出A4HS1均表现出了比HS-1天然更强的免疫抑制作用，已经达到或超出了阳性对照(环孢菌素)的免疫抑制作用。文档编号C07K1/02GK101289497SQ200810061030公开日2008年10月22日申请日期2008年5月1日优先权日2008年5月1日发明者琪徐,湘李申请人:杭州中肽生化有限公司