专利名称：共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体、重组腺病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组腺病毒，特别是涉及IRES介导的 共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体、重组腺病毒及其应用。
背景技术：
移植是末期组织器官功能衰竭的根治性治疗手段。受者对移植物的排斥是移植成 功的主要障碍。近年来，免疫抑制剂的应用推动了器官移植的发展，但是，长期应用 免疫抑制剂所引起的多种毒副作用，不仅严重影响了患者的长期生存质量，也极大地 限制了器官移植的开展。诱导供者特异性免疫耐受为最终摆脱非特异免疫抑制剂的毒 副作用提高受者生存质量带来了希望。随着基因转移技术的迅速发展及基因治疗理论 和实践的不断完善，基因治疗逐渐成为在分子水平研究移植免疫耐受的重要手段。
T细胞是移植排斥的主要效应细胞，防止同种异型反应T细胞活化是防止移植排 斥发生的主要途径。T细胞活化增殖必须同时存在MHC/抗原肽-TCR和协同刺激信号， 阻断协同刺激信号将导致T细胞无能、凋亡或克隆丢失而引发免疫耐受。B7/CD28途 径在协同刺激信号通路中的作用最为肯定，干预该途径诱导特异性耐受已成为移植免 疫调节的基本思路。作为T细胞表面B7分子的另一个配体，细胞毒性T淋巴细胞相 关抗原4 (CTLA-4)与B7分子的亲和力较CD28高数十倍而优先结合B7分子并传递负 调控信号，从而阻断T细胞活化。CTLA4-Ig是CTLA-4胞外段与IgG Fc段的融合蛋白， 与细胞表面的B7分子结合起到封闭作用，通过阻断B7/CD28协同刺激通路而达到抑 制T细胞活化的目的。
内部核糖体进入位点(internal ibosome entry site, IRES)是小RNA病毒类中5， 端非翻译区中的一段序列，其二级结构和三级结构构成了蛋白质翻译过程中核糖体的 登陆平台，40s核糖体亚单位可以不依赖5'端帽子结构而在内部结合到mRNA上，从 而直接对其后的结构基因进行翻译。IRES的这一特点可应用于构建同时表达两个基因 的双顺反子真核表达载体。
腺病毒(Adenovirus, Ad)载体系统具有如下特点a、病毒基因组不整合到宿 主的基因组中，也就不会影响宿主结构基因的正常表达；b、可插入较大的外源基因
片段(8.5kb) ; C、可感染分裂细胞也可感染非分裂细胞，感染谱比较广；d、瞬时
表达而不是终身表达，另外载体上带有GFP (绿色荧光蛋白)报告基因，可以通过绿 色荧光蛋白的示踪很直观地观察到外源基因的表达。由于腺病毒载体在哺乳动物及其 多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性，使其在基因治疗的研究中受到人们的 青睐，成为当今使用最多的病毒载体之一。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种IRES介导的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病 毒载体。
本发明所提供的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体，是先将CTLA4Ig基 因、IRES基因和CTLA4基因顺次插入pAdTrack-CMV穿梭载体中巨细胞病毒(CMV)启动 子的下游，得到携带CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体，再将该 重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1共转化细菌后得到的携带有CTLA4Ig和 CTLA4基因的腺病毒质粒载体。
该腺病毒质粒载体为胞外分泌性表达CTLA4Ig，所述CTLA4Ig基因的5'端还连 接有抑瘤素M信号肽编码序列。
所述携带CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体与病毒骨架载体 pAdeasy-l共转化的细菌为A co"' BJ5183，随后，在该细菌内进行同源重组。
具体来讲，所述共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体可简称为 pAdeasy-CIC。
本发明的另一个目的是提供一种共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒。 本发明所提供的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒，将上述共表达CTLA4Ig
和CTLA4的重组腺病毒载体转染包装细胞一人胚肾293细胞(HEK 293)得到的。
所述共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体可通过脂质体介导法转染人胚肾
293细胞。
所述共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒感染的哺乳动物细胞也属于本发明的 保护范围。
所述哺乳动物细胞可包括干细胞(如骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等)、组织 细胞、树突细胞和骨髓单个核细胞等。
本发明公开了一种由IRES介导的CTLA4Ig (分泌型)及CTLA4 (膜结合型)双基 因共表达的重组腺病毒载体及共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒。所述重组腺病 毒是将本发明携带有CTLA4Ig及CTLA4基因的双顺反子腺病毒质粒载体转染包装细胞 得到的。该重组腺病毒可高效感染哺乳动物细胞(如干细胞或组织细胞等)，并在IRES 的介导下同时表达分泌型CTLA4-Ig和膜结合型的CTLA4。实验证明，受本发明重组腺 病毒体外感染的大鼠骨髓间充质干细胞，可分别在基因水平和蛋白水平检测到 CTLA4Ig及CTLA4的共表达，同时，利用CTLA4的免疫抑制作用，可以两种形式同时 阻断抗原特异性T细胞活化所需的B7/CD28协同刺激信号，使T细胞活化受阻，从而 使得被感染的细胞具有抑制免疫反应的作用。若将本发明的重组腺病毒应用于器官移 植中(如制成免疫抑制剂，包括实验制剂和药物)，可抑制移植排斥反应的发生，诱 导供者特异性免疫耐受，从而减少或最终摆脱非特异免疫抑制剂的应用，为提高受者 生存质量带来了有利保障。本发明将在医学领域，尤其是器官移植领域中发挥重要作 用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1A为通过RT-PCR从活化的大鼠脾细胞中获得CTLA4全长、CTLA4胞外段及
IgGFc段基因片段连接入pT-Easy载体的酶切鉴定结果
图1B为构建携带CTLA4Ig融合基因质粒pIRES2-CTLA4Ig酶切鉴定结果
图1C为构建重组腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CIC的酶切鉴定结果
图1D为构建重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC的酶切鉴定结果
图2为重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC在293A细胞中包装的显微镜观察结果
图3A为经纯化及传代培养的大鼠骨髓间充质干细胞的细胞形态
图3B为重组腺病毒Ad-CIC感染大鼠骨髓间充质干细胞感染效率的流式细胞术鉴
定结果
图3C为重组腺病毒Ad-CIC感染大鼠BM丽SCs后GFP表达的荧光显微镜观察结果
图3D为转基因BMDMSCs CTLA4Ig和CTLA4共表达的RT-PCR鉴定结果
图3E为转基因BMDMSCs CTLA4Ig和CTLA4共表达的Western Blotting鉴定结果
图4为单向混合淋巴细胞反应检测转基因B腦MSCs免疫抑制功能的鉴定结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, DavidW.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(w/v)百分比浓度或体积/体积(v/v)
百分比浓度。
所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由上海英骏公司完成。 实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以 达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生
物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照 实施例中的提示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的 各种细胞均为离体的，并包括从细胞库中取得、或商业购买获得，还包括按照已有文 献的介绍制备获得，以及经可以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。
实施例1、构建分泌性表达CTLA4Ig和膜结合型表达CTLA4的腺病毒质粒载体 pAdeasy—CIC
一、大鼠CTLA4全长、CTLA4胞外段和IgGFc段基因片段的获得 取雄性Wistar大鼠(购自军事医学科学院动物中心)，拉颈处死，在无菌条件 下摘取脾脏，用眼科弯镊挤压脾脏组织，过400目筛网收集脾细胞悬液于50mL离心 管中，离心，弃上清，洗涤细胞沉淀，用含10^胎牛血清的RPMI1640 (Sigma公司产 品)培养液(预先加入青-链霉素100U/mL)重悬细胞。将分离得到的脾细胞按2X107cm 2的浓度接种于50mL塑料培养瓶内，向其中加入刀豆蛋白A(ConA，购自Sigma公司) 至终浓度为5ug/mL，置于37°C、 5% C02和饱和湿度的孵箱中进行培养，培养72h 后，离心，洗涤细胞。将细胞收集于1.5mL EP管中，加入lmL TRizol试剂(购自 Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书提取ConA刺激增值细胞的总RNA，然后以提 取的总RNA为模板，反转录其中的mRNA为cDNA， 20y 1反转录体系及反应条件为5 X認V反转录缓冲液4p1， dNTPs(10mM) 2ul， RNAse抑制剂0.5ul， olig dT ly l，AMV反转录酶l，mRNAO. 2y l，DEPC处理水10. 3 y 1， 42。C反应lh。根据GeneBank 公布的大鼠CTLA4 (GenBank号:NP—113862)及IgGFc段(GenBank号:X07189)序
列分别设计并合成引物，引物序列如下
扩增CTLA4全长的引物 pl (上游引物)5， -CATCCATGGCTTGTCTTGGACTCCAGA-3， p2(下游引物)5， -TAAGCATGCCTCGAGTCAGTTGATTGGAATAAAATAAGGTTG-3，； 扩增IgGFc段的引物
p3 (上游引物)5， -ACTCCGCGGATTGAGCCCAGAAGACCCAA-3，
p4 (下游引物)5， -ACTGGATCCGTCGACCTATTTACCAGGAGAGCGGGACA-3，；
扩增CTLA4胞外段的引物 p5 (上游引物)5， -GTGACCCAACCTTCAGTGGTG-3， p6 (下游引物)5， -ACTCCGCGGGTCTGAATCTGGGCATGGTTC-3'。
以合成的cDNA为模板，分别在上述三对引物的引导下进行PCR扩增，20ulPCR 反应体系为IOXPCR缓冲液2p1， dNTPs(2.5mM) 1.6nl，上、下游引物各0.5iU， 模板4ul，rTaq酶0. 2ul，重蒸水11. 2 u 1。反应条件均为先94°C 40s， 51°C 40s， 72°C 40s，共30个循环；最后一个循环结束后延伸7min。 PCR反应结束后，对PCR 扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增获得了 CTLA4全长、CTLA4胞外 段和IgGFc段的特异性片段，大小分别为692bp、 378bp、 716bp。切胶回收PCR扩增 产物，将三个回收片段分别连入pGEM-T-Easy载体(购自Promega公司)中，然后将 连接产物分别转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，经过100 u g/mL氨苄青霉素抗性筛选 及"蓝白筛选"，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，用对携带有不同目的片段 的重组质粒进行单酶切鉴定，结果如图1A所示(泳道1: DL2000 marker,泳道2:CTLA4 全长，泳道3: IgGFc段，泳道4:CTLA4胞外段)，携带有CTLA4全长的重组质粒(命 名为pT-Easy-CTLA4)可获得692bp的酶切片段，携带有CTLA4胞外段的重组质粒(命 名为pT-Easy-CTLA4胞外段)可获得378bp的酶切片段，携带有IgGFc段的重组质粒 (命名为pT-Easy-IgGFc)可获得716bp的酶切片段，与预期结果一致。再对三种质 粒进行序列测定，结果与GeneBank公布的大鼠CTLA4全长、CTLA4胞外区和IgGFc段 的基因序列完全一致，表明获得了序列正确的大鼠CTLA4全长、CTLA4胞外段和IgGFc 段基因片段。
二、 5'端连接有抑瘤素M信号肽编码序列的CTLA4Ig融合基因的获得 根据GeneBank公布的去除信号肽的大鼠CTLA4胞外区编码序列及抑瘤素M信号 肽编码序列(GenBank号:NM—020530)设计引物，引物序列如下 p6: 5， -ACTCCGCGGGTCTGAATCTGGGCATGGTTC-3，； p8: 5， -CTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGTGACCCAACCTTCAGTGGTG-3，； p9: 5， -CAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGC-3，； pl0: 5' -TCAGAATTCAGATCTATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTC-3，。 经过三次PCR扩增，引物分别为p8+p6， p9+p6和pl0+p6，第一次PCR反应以步骤 一获得的CTLA4胞外区片段为模板，以后每一次PCR模板为前一次PCR扩增产物，50 iil PCR反应体系为10XPyrobest Buffer缓冲液5iil， dNTPs(2. 5mM) 4ul，上、 下游引物各1.5yl，模板6ul，尸jroZ;eW DNA聚合酶0.25ul，重蒸水31.75"1。 PCR反应条件均为先94°C 40s， 53°C 40s， 72°C 40s，共30个循环；最后一个循 环结束后延伸7min。反应结束后，对最终PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测， 可见453bp的特异性条带出现，与预期结果一致。切胶回收该目的片段，并在末端加 A尾，10y 1反应体系及反应条件为IOXPCR缓冲液lwl，凝胶回收产物7u 1， dATP (2raM) lul， rr邵酶lnl，在72。C条件下反应30分钟。然后，将加尾产物连接于 pGEM-T-Easy载体中，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，经过100ug/mL 氨苄青霉素抗性筛选及"蓝白筛选"，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，进行序列测定，
测定结果证实在CTLA4胞外段上游(5'端)成功引入抑瘤素M信号肽序列，将该融 合基因命名为M信号肽-CTLA4胞外段，将携带有该融合基因的克隆载体命名为pT-M 信号肽-CTLA4胞外段。
取质粒pT-M信号肽-CTLA4胞外段及pIRES2-EGFP (购自美国BD公司，先用fcof I酶切，凝胶电泳回收两种质粒的Acot I酶切产物，再用5"3c II酶切该酶切产物， 20ii 1酶切体系及反应条件分别为(1)10XH Buffer2u 1， fco/ I liil，质粒5ul， 重蒸水12yl， 37。C酶切2h; (2)10XT Buffer2 u 1， 0. l%BSA2ul，II lul， 质粒5ixl，重蒸水10ul， 37"酶切2h。再凝胶电泳回收两种质粒的II酶切产 物。应用快速连接试剂盒(购自TaKaRa公司)对电泳回收的酶切片段进行连接反应， 即将M信号肽-CTLA4胞外段片段连接入载体pIRES2-EGFP中，将该重组载体命名为 pIRES2-CTLA4胞外段，12 u 1连接体系及连接条件为质粒酶切片段3ul，插入片段 3wl， Solution I 6 ii 1，混匀后在16T:水浴中反应30分钟。反应结束后，将连接产 物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，经过25 u g/mL卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆， 摇菌，提质粒，用iboWI及II进行双酶切鉴定，结果经酶切获得了 453bp和5. 3kb 的DNA片段，与预期结果相符。先后用I和II分别酶切上述重组质粒 pIRES2-CTLA4胞外段及pT-Easy-IgGFc质粒，20 u 1酶切体系及反应条件分别为(1) 10XK Buffer 2 u 1， 5a/z^Ilul，质粒10ul，重蒸水7ul，混匀后，37。C酶切2h; (2)10XT Buffer 2 ii 1， 0. l%BSA2yl， Ssc IIlul，质粒10iU，重蒸水5ul， 混匀后，37"C酶切2h。反应结束后，对两种质粒的双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电 泳，回收5. 3kb的pIRES2-CTLA4胞外段酶切片段及716bp的pT-Easy-IgGFc酶切片 段，用快速连接试剂盒对两酶切片段进行连接反应，即将IgGFc片段插入质粒 pIRES2-CTLA4胞外段的下游，得到含有CTLA4Ig融合基因(5'端连接有抑瘤素M信 号肽序列)的重组载体，命名为pIRES2-CTLA4Ig，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感 受态细胞，经过25wg/mL卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，用fco/ I和I进行双酶切鉴定，鉴定结果如图1B所示(泳道1为DL2000 marker,泳 道2、 3、 4为pIRES2-CTLA4Ig酶切片段)，经酶切得到了大小约1170bp的特异性条 带，与预期结果相符。将该重组质粒-2(TC保存备用。
三、构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig-IRES2-CTLA4(pAdTrack-CIC) 用I和《§7 II分别双酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV (购自美国 stratagene公司)和质粒pIRES2-CTLA4Ig， 20 n 1酶切体系及反应条件为10XH Buffer 2nl，质粒10yl，I lul，II lul，重蒸水6iU，混匀，37。C水 浴反应2h。反应结束后，对两种双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收 线性化的pAdTrack-CMV穿梭质粒和CTLA4Ig融合基因片段(5，端连接有抑瘤素M信 号肽序列)，应用快速连接试剂盒将CTLA4Ig融合基因片段连入线性化的穿梭质粒 pAdTrack-CMV中，连接体系及反应条件为pAdTrack-CMV质粒1， CTLA4Ig片段6 ul， Solution I 10nl，在16。C水浴中反应30分钟。反应结束后，取2 u 1连接产 物常规转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经过25ug /mL卡那霉素抗性筛选，挑取阳 性克隆，摇菌，提质粒，用I和II进行双酶切鉴定，结果经酶切得到了大 小约1170bp的特异性条带，与预期结果相符。将该携带有CTLA4Ig融合基因片段(5' 端连接有抑瘤素M信号肽序列)的重组质粒命名为pAdTrack-CTLA4Ig。 -2CTC保存质 粒备用。
挑取前述"蓝白筛选"平板上的蓝色克隆，此为自身环化的pGEM-T-Easy载体， 摇菌，提取质粒。用5o力I和I双酶切步骤一获得的CTLA4全长基因片段，20 u L酶切体系及反应条件为10XK Buffer 2 y 1，质粒10ul， 0. 1 %BSA 2 u 1， &力I lnl， 7Kco I lul，重蒸水5wl，混匀，37"水浴反应2h。然后，应用快速连接试 剂盒通过这两个位点将CTLA4全长基因片段连接入自身环化的pGEM-T-Easy载体中， 得到携带CTLA4全长基因片段的正向重组质粒，命名为pT-CTLA4。再用^co/ I和
I双酶切pT-CTLA4和pIRES2-EGFP，酶切体系同上。酶切后，对两种酶切产物进 行1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收585bp的IRES2片段与692bp的PT-CTLA4双酶切 产物，再将两者连接，10ul连接体系及连接条件为pT-CTLA4双酶切产物lyl， IRES2 3ul， T4DNA连接酶lul， 2X连接buffer 5 n 1，混匀后，4。C连接过夜(12-24 小时)。反应结束后，将连接产物常规转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经过100iig /mL氨苄青霉素素抗性筛选，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，用fa^I和AfcoI进行 双酶切鉴定，结果经酶切得到了大小约1276bp的特异性条带，与预期结果相符。将 该携带有IRES2基因和CTLA4全长基因片段(命名为IRES2-CTLA4)的重组质粒命名 为pT-IRES2-CTLA4。 -20。C保存质粒备用。
用I和J力o I分别对重组质粒pT-IRES2-CTLA4和pAdTrack-CTLA4Ig进行双 酶切，20ti 1酶切体系及反应条件为10XH Buffer 2 u 1，质粒10pl， 5^〗11ul， J力o I lul，重蒸水6ul，混匀，在37。C水浴中反应2h。反应结束后，对两种双酶 切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收1.0kb的线性化重组穿梭质粒 pAdTrack-CTLA4Ig和1276bp的IRES2-CTLA4片段，然后以3:1的摩尔比将 IRES2-CTLA4片段连接入线性化的质粒pAdTrack-CTLA4Ig中，10 y 1连接体系及连接 条件为pAdTrack-CTLA4Ig lul， IRES2-CTLA4片段3iU， T4 DNA连接酶lul， 2 X连接buffer 5 ul，混匀后，4'C连接过夜。反应结束后，将连接产物常规转化大肠 杆菌DH5a感受态细胞，经过25yg /mL卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，接种于 5mLLB液体培养基(含25ug/mL卡那霉素)中在37'C下摇菌过夜，提质粒，用JMt 和《 7 II进行双酶切鉴定，结果如图1C所示(泳道1为DL15000 DNA marker,泳道 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8为重组质粒酶切片段)，经酶切得到了大小约2483bp的特异性 条带，与预期结果相符。将该携带有目的基因片段的腺病毒穿梭质粒命名为 pAdTrack-CTLA4Ig-IRES2-CTLA4 (简称pAdTrack-CIC) 。 -2(TC保存质粒备用。
四、细菌内同源重组获得腺病毒质粒pAdeasy-CIC
用冰WB液(10%超纯甘油+ 90%无菌水)制备大肠杆菌BJ5183感受态细菌，40 ul/EP管分装，-7(TC保存备用。用限制性内切酶尸历el (购自Biolab公司)切重组 穿梭质粒pAdTrack-CIC，使其线性化，反应体系及反应条件为穿梭质粒1 u g， 1 %BSA 0. 2yl， 10XNEB Buffer 4 2yl，lyl，添加双蒸水至20iil，在37°C 下孵育2h。反应结束后，用70%乙醇沉淀线性化质粒，室温干燥15min后，溶于5 u 1 ddH20中。再将线性化的穿梭质粒pAdTrack-CIC与100ng超螺旋腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1 (购自美国stratagene公司)用电穿孔法共转化至40 u 1大肠杆菌BJ5183 感受态细胞中进行同源重组，电转化条件为2500V， 200Q， 25uF。然后，将菌液 从电转杯中移入EP管中，添加900 y 1 LB液体培养基，在37。C下温和振摇(150 r/min) 培养45min。分别取100ul、 200yl、 300 u 1菌液涂布于含25 y g/mL卡那霉素抗性 的LB平板上，在该受体菌中pAdTrack-CIC与pAdEasy-1的同源序列之间同源重组， 重组后的质粒由原来的pAdEasy-1氨苄青霉素抗性变为卡那霉素抗性，因此只有重组 体或pAdtrack-CMV才具有卡那霉素抗性。将抗性平板置于37。C下孵育16-20h。选取 在卡那霉素抗性平板上长出的8个小克隆，分别接种于5mL含25 u g/mL卡那霉素的 LB培养液中，在37'C下摇菌过夜。培养结束后，提取质粒，通过0.7%琼脂糖凝胶电 泳进行初步鉴定，结果重组质粒均大于40kb，与预期结果相符。根据电泳结果，选取 重组质粒，用限制性内切酶尸scl (购自Biolab公司)进行单酶切，酶切反应体系及 反应条件为重组质粒lug， l%BSA0.2ul， 10XNEB Buffer 1 2ul，尸acl lul， 添加双蒸水至20ul，在37'C下孵育2h。反应结束后，对酶切产物进行0.7%琼脂糖 凝胶电泳鉴定，结果如1D所示(泳道1为DL15000 DNA marker,泳道2、 3、 4、 5为 酶切片段)，经酶切可以产生4.5kb小片段及38.6kb的大片段，检测结果证明成功 构建了携带有CTLA4Ig融合基因(5'端连接有抑瘤素M信号肽序列)、IRES2基因和 CTLA4全长基因片段(命名为CTLA4Ig-IRES2-CTLA4)的重组腺病毒质粒，命名为 pAdeasy-CIC。将经鉴定的阳性重组子二次转化至大肠杆菌DH 5 ct感受态细胞，提取 重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC，用尸sc I酶切5 y g重组腺病毒质粒使其线性化，酶切
条件为在37。C下孵育2h。向其中加入等体积酚/氯仿，混匀，4°C、 12000rpm离心 2min。将上清转移至另一 EP管中，加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，室温放置2min， 然后4。C， 12000rpm离心5min。去除上清，再向沉淀中加入70%乙醇，混匀，4°C、 12000mm离心5min。去除上清，室温干燥沉淀15rain。最后，向沉淀中加入50ul无 菌TE缓冲液溶解质粒，贮存于-20C备用。
实施例2、脂质体介导重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC转染人胚肾293A细胞进行病毒包装及扩增与滴度测定
一、 脂质体介导重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC转染人胚肾293A细胞进行病毒包装
在准备转染前l天，用60mm平皿中接种7.5X105人胚肾293A细胞(购自南京凯 基生物有限公司))，置于37。C、 C02培养箱中培养。转染前3-4h进行换液，以保证 细胞呈指数生长(加5mL培养基)；准备转染用实施例1获得的线性化质粒pAdeasy-CIC 和脂质体Lipof ectamine 2000 (购自Invitrogen公司)(1)用500 " 1无血清DMEM 培养液(购自Sigma公司)稀释15-20 u g线性化pAdeasy-CIC质粒DNA; (2)用500 u 1 无血清DMEM稀释20 u 1脂质体Lipof ectamine 2000，轻轻混匀，不超过5min; (3) 将(1)和(2)混匀(轻弹)作用20min (不超过30min)。将线性化pAdeasy-CIC 质粒丽A与脂质体混合物加入培养皿中，轻轻混匀后，置于37、 5%〔02培养箱中孵 育10-12h。弃掉培养基，洗1-2次，改用含5X胎牛血清的DMEM培养基5mL，在相同 条件下继续培养48h后，换新培养基匿EM (含5%胎牛血清)，用荧光显微镜观察重 组腺病毒(命名为Ad-CIC)的产生，腺病毒的产生可通过其表达的GFP进行监测。在 脂质体介导转染7-10天后，可以清楚地看到细胞病变效应(cytopathic effect, CPE) 的发生，即细胞开始聚集并且从平皿上脱落，当所有细胞都出现该现象就认为完全发 生了 CPE。完全的CPE发生在转染后10-14天出现，结果如图2所示(A为光镜下结 果，B为荧光显微镜下结果)。在完全CPE后收集细胞，于-70C和37。C之间反复冻 融3-4次，然后4。C、 5000rpm离心10min，去除细胞碎片，将包装好的腺病毒毒液进 行分装，100ul/管，冻存于-70C备用。
二、 重组腺病毒的扩增
将293A细胞接种于60隱平皿中，单层培养36h达90%融合时(约5-10X 107 平皿)，吸去单层细胞培养基，小心加入50wl步骤一获得的重组腺病毒Ad-CIC毒 液，并添加无血清DMEM培养液，使之刚好覆盖到有细胞的平皿。小心晃匀，在37。C、 5XC02培养箱中培养20min后，再将培养液晃匀；培养2h后，小心加入5mL新配制的含5X胎牛血清的DMEM培养基；培养3-4天，用荧光显微镜观察GFP表达情况及细胞 的CPE现象。待细胞完全CPE后，收集细胞悬液，反复冻融3次，将重组腺病毒Ad-CIC 从胞体上释放出来，4°C、 5000rpm低速离心10min，去除细胞碎片。为得到滴度更高 的病毒，如此反复"感染-收集-冻融"3次。将最终获得的腺病毒毒液分装后-7(TC冻 存。
三、重组腺病毒Ad-CIC的滴度测定(TCID50法)
收集293A细胞，用含2X胎牛血清的高糖DMEM培养液稀释细胞，使其浓度为1 X10VraL。取两个96孔板，每孔分别加入100iil细胞悬液(1X10V孔)，置37。C、 5% c02培养箱中培养24h。取Ad-CIC毒液100ul稀释于990yl的培养液(2X胎牛 血清的高糖DMEM)中(102倍稀释)，混匀后，取200iil稀释于1.8mL培养液中(10:i 倍稀释)，如此进行系列稀释，直至1(T倍稀释。向96孔板每排前10个孔加入100 u 1 稀释好的病毒液，A排-G排孔的病毒稀释度依次为103， 104， 105-10"倍。每排孔的病 毒稀释倍数相同。向各排孔加毒液时，要从高稀释倍数开始，余孔加100ul培养液 作阴性对照。将2个96孔板置37。C、 5%〔02培养箱中培养10天。IO天后，在显微镜 下计数每排发生cpe孔数的比例，带入公式t二i。' )TCID50/mL (T滴度，D=Log 稀释倍数，S二阳性比例的总和)，将TCID50/mL转化为PFU/mL的公式为TCID50/mL 二lX10"PFU/niL。最后测得收获的重组腺病毒Ad-CIC的滴度为6. lX107PFU/mL。
实施例3、检测重组腺病毒Ad-CIC体外转染目的细胞的转染效率、表达情况 以大鼠骨髓间充质干细胞(BMDMSCs)为例，检测本发明重组腺病毒Ad-CIC体外 感染目的细胞(哺乳动物细胞)的感染效率、目的基因的表达鉴定，具体检测方法如
下
一、大鼠骨髓间充质干细胞(BMDMSCs)的分离
取雄性LEWIS大鼠(购自北京维通利华实验动物中心)，拉颈处死后浸入75%酒 精10分钟。用无菌剪刀等手术器械分离大鼠股骨，用注射器吸取低糖DMEM培养液(购 自Sigma公司)反复冲洗骨髓腔至颜色发白(约3-4次)。用400目筛网过滤冲洗液， 离心，弃上清，收集细胞。将骨髓细胞沉淀用PBS重悬，然后将其轻轻叠加到密度为 1.083g/mL的大鼠淋巴细胞分离液(购自TBD公司)上，1800rpra离心30分钟(室温 下)，小心吸取界面间的乳白色单个核细胞层，加入含10X胎牛血清的DMEM培养液 (预先加入青-链霉素100U/mL)中充分混匀，离心，弃上清，洗涤细胞沉淀。将分离 的细胞按2 X 107cm2的浓度接种于装有低糖謹EM完全培养液的50mL塑料培养瓶中， 置于37。C、 5% C02和饱和湿度的孵箱中培养48h后更换新鲜培养液，弃掉未贴壁细
胞，以后每隔2-3天换液一次。待细胞长到80%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化
细胞进行传代培养，方法为用细巴斯德吸管将消化细胞吹打成单细胞悬液后，以1 X105/mL的浓度接种于新的低糖DMEM培养液中，每隔2-3天换液一次，细胞传代， 细胞形态如图3A所示，表明得到了经纯化的BMDMSCs，备用。
二、重组腺病毒Ad-CIC体外感染BMDMSCs及感染效率的流式细胞术检测
1、 M0I值(Multiplicity of Infection)测定
向六孔板的各孔中分别种入2X10S个293A细胞，常规培养24h后，分别用0、 2、 5、 10、 25、 50 ul Ad-CIC重组腺病毒毒液感染细胞，继续培养72h。在显微镜下观 察，发现加入50til病毒液的孔发生完全CPE，根据以下公式计算MOI值
PFU/ml x V(加入病毒体积) 6.1 x l07PFU/ml x0.05 ml (加入病毒体积)
接种细胞数 2x 105
根据AdEasy Vector Systerm操作说明书提示，此病毒液的体积相当于M0I = 10-20，所以计算结果与粗略估计的病毒滴度相当。
2、重组腺病毒Ad-CIC体外感染BMDMSCs的感染效率测定
将扩增至第3代的大鼠BMDMSCs按2 X 105/瓶接种于4个T 25-cm2的塑料培养瓶 中，常规培养24h后，向各瓶依次加入MOI值为0、 50、 100、 150的病毒量的重组腺 病毒Ad-CIC毒液感染细胞，置37'C、 5XC02培养箱中培养48h。培养结束后，用0. 25 %胰酶消化各瓶细胞，离心，洗涤，重悬于500ul的PBS缓冲液中，用流式细胞仪 检测各管细胞的GFP的表达率。结果如图3B所示，M0I值为150时，感染效率可达到 98. 67%。
三、重组腺病毒Ad-CIC在BMDMSCs中的表达鉴定
1、 GFP表达鉴定
用0. 25%胰酶消化第3代大鼠BMDMSCs，按2X 105/瓶接种于4个T-25cii^的塑料 培养瓶中，培养24h后，按MOI二150的病毒量用Ad-CIC感染细胞，分别培养1、 3、 7、 14天后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况，结果如图3C所示，感染24h即有 GFP表达，在第3天时表达量最强，以后逐渐开始减弱，在第14天时仍有表达。
2、 RT-PCR鉴定基因水平CTLA4Ig及CTLA4的共表达
按M0I 二 150的病毒量用Ad-CIC感染第3代大鼠B腦MSCs ，常规培养3天，用TRIZ0L 试剂并参照试剂盒说明书提取被感染细胞的总RNA，然后以提取的总RNA为模板，反 转录其中的mRNA为c丽A， 20ul反转录体系为5XAMV反转录缓冲液4ul，
dNTPs(10mM) 2p1， RNAse抑制剂lwl， AMV反转录酶0. 5ul， raRNA 2ul，重蒸水 11.5ul。然后以合成的cDNA为模板，分别在CTLA4Ig引物P1 (上游引物)5，-ATGGGGGTACTGCTCACACA-3，及P2 (下游引物)5， -CTATTTACCAGGAGAGCGGGA-3，和 CTLA4全长引物P1 (上游引物)5， -CATAGATCTATGGCTTGTCTTGGACTCCAGA-3，及P2 (下 游引物)5， -TAACTCGAGTCAGTTGATTGGAATAAAATAAGGTTG-3'的引导下进行PCR扩增， 20u 1 PCR反应体系为10XPCR缓冲液2yl， dNTPs(2. 5mM) 1.6ul，正、反向引 物各lul，模板ltil， r乃。酶0.2ia，重蒸水13.2ul。同时，以大鼠"-actin 基因为参照，用于扩增大鼠"-actin基因的引物序列为P3'(上游引物)5' -AGAAAATCTGGCACCACACC-3，和P4，(下游引物)5， -AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3，。 PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3D所 示(泳道l、 7为DL15000 DNA marker,泳道2为Ad-CTLA4全长感染BMDMSCs，泳道 3为Ad-CIC感染BMDMSCs，泳道4为Ad-CTLA4Ig感染BMDMSCs， Ad-GFP感染BMDMSCs， 泳道5为BM腿SCs)，可见大小约为U70bp的特异性条带出现，表明目的基因CTLA4Ig (1170bp)和CTLA4全长(692bp)在经Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs的mRNA水平上 均获得表达，且前者的表达量明显髙于后者。
3、 Western blotting鉴定蛋白水平CTLA4Ig及CTLA4的共表达 按M0I二150的病毒量用Ad-CIC感染第3代大鼠BMDMSCs，常规培养3天后，取 107个被重组腺病毒Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs,并以AchGFP (用上述相同方法获得 的不含外源基因CTLA4Ig-IRES-CTLA4基因，仅含有GFP基因的重组腺病毒)、 Ad-CTLA4Ig (用上述相同方法获得的不含外源基因IRES-CTLA4，仅含有GFP基因和 CTLA4Ig基因的重组腺病毒)、Ad-CTLA4(用上述相同方法获得的不含外源基因CTLA4Ig 基因和IRES基因，仅含有GFP基因和CTLA4全长基因的重组腺病毒)感染的大鼠 BMDMSCs作对照，分别加入200 n 1 RAPA细胞裂解液(50mM Tris， 150mM NaCl， 5mM EDTA， 1%NP40， 0.5%脱氧胆酸钠，0. 1%SDS， lmMPMSF， 10u g/mL aprotinin， lmMNaV04) 在4。C下裂解过夜，然后12000rpm离心30分钟，吸取上清，用BCA法测定蛋白浓度 为4900ix g/mL。然后，取等量的经不同重组腺病毒感染的细胞裂解液进行不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，再用半干式转印的方法将蛋白质转移至PVDF膜 上，接着用5%脱脂奶粉封闭2小时， 一抗均为兔来源抗CTLA4抗体(购于santacruz 公司)，4'C孵育过夜(12-24小时)，用TBST洗膜3次，每次10分钟，然后加入辣 根过氧化物酶偶连的抗兔二抗(购于中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育l小时 后，用TBST洗膜4次。最后，用ECL化学发光检测试剂盒(购自Santa Cruz公司) 于暗室自显影。检测结果如图3E所示，发现被本发明重组腺病毒Ad-CIC感染的大鼠
BMDMSCs中同时表达有CTLA4Ig和CTLA4全长蛋白，而对照组未出现CTLA4Ig和CTLA4 全长蛋白共表达，与预期结果相符，从而在蛋白水平上证明CTLA4Ig和CTLA4全长在 经Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs中获得表达。
实施例4、检测被重组腺病毒Ad-CIC体外转染的目的细胞的免疫抑制功能(混合 淋巴细胞反应，mixed lyphocyte response, MLR)
以大鼠骨髓间充质干细胞(BMDMSCs)为例，检测本发明重组腺病毒Ad-CIC体外 感染目的细胞(哺乳动物细胞)后，目的细胞的免疫抑制功能。
按M0I = 150的病毒量用Ad-CIC感染感染扩增至第3代的大鼠腿DMSCs 24h后， 依次用0. 25%胰酶和0. 02%EDTA消化受感染的服頭SCs，离心，洗涤，加入丝裂霉 素C (终浓度为25ug/raL)，再将感染细胞置于37。C， 5XC0j瞎箱中孵育30min。然 后，洗涤细胞3次，用含10X胎牛血清的低糖DMEM培养液重悬细胞，按1X107孔、 1X107孔、1X107孔的密度接种到96孔板中，在相同条件下继续培养过夜。同时以 同样密度接种的重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMDMSCs作为对照。
拉颈处死LEWIS大鼠(购自北京维通利华实验动物中心)及DA大鼠(购自哈尔滨 医科大学实验动物中心)各1只，无菌剖取其脾脏分离脾细胞。向DA大鼠脾细胞重悬 液中加入丝裂霉素C (终浓度为25ug/mL)，置37。C、 5%0)2孵箱中孵育30min，洗 涤3次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1 X 107mL，用作MLR 的刺激细胞。将LEWIS大鼠脾细胞作为反应细胞，同样用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液调整细胞浓度为1Xl07mL。吸去上述预先接种有转基因大鼠BMDMSCs的96孔 板中的培养液，然后向每孔中分别加入100n 1的反应细胞和刺激细胞悬液建立混合 淋巴细胞培养体系，混匀后将96孔板置于37。C， 5XC02孵箱中培养56h，加3H标记 的脱氧胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR，中国科学院原子能研究所)，标记16h，用细胞收 集器收集细胞于滤纸上，烤干后，加入闪烁液，用液体闪烁计数仪(Beckman公司) 检测cpm值，并进行比较分析。结果如图4所示(Control为阴性对照)，被腺病毒 Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs具有抑制培养体系中反应细胞增值的作用，且其抑制作用 强于被腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMDMSCs,证明本发明共表达CTLA4Ig及CTLA4 的腺病毒Ad-CIC可以更高效地阻断T细胞的活化，具有较强的免疫抑制功能，说明 可用于制备免疫抑制剂，包括实验制剂和药物。
权利要求
1、共表达CTLA4Ig和CTLA4的腺病毒表达载体，是先将CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因顺次插入pAdTrack-CMV穿梭载体中巨细胞病毒启动子的下游，得到携带CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1共转化细菌后得到的携带有CTLA4Ig和CTLA4基因的腺病毒质粒载体。
2、 根据权利要求1所述的腺病毒表达载体，其特征在于所述CTLA4Ig基因的5' 端还连接有抑瘤素M信号肽编码序列。
3、 根据权利要求1或2所述的腺病毒表达载体，其特征在于所述携带CTLA4Ig 基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1共转化的细 菌为AcW/ BJ5183，随后，在该细菌内进行同源重组。
4、 根据权利要求3所述的腺病毒表达载体，其特征在于所述共表达CTLA4Ig 和CTLA4的腺病毒表达载体命名为pAdeasy-CIC。
5、 共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒，是将权利要求1-4任一项所述共表 达CTLA4Ig和CTLA4的腺病毒表达载体转染人胚肾293细胞得到的。
6、 受权利要求5所述的重组腺病毒感染的哺乳动物细胞。
7、 根据权利要求6所述的哺乳动物细胞，其特征在于所述哺乳动物细胞包括 干细胞、组织细胞、树突细胞和骨髓单个核细胞。
8、 根据权利要求7所述的哺乳动物细胞，其特征在于所述干细胞为骨髓间充 质干细胞或脂肪干细胞。
9、 权利要求5所述的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒在制备免疫抑制剂 中的应用。
10、 根据权利要求9所述应用，所述免疫抑制剂为实验制剂或免疫药物。
全文摘要
本发明公开了IRES介导的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体及重组腺病毒。是先将CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因顺次插入pAdTrack-CMV穿梭载体中巨细胞病毒启动子的下游，得到携带CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1进行同源重组后得到的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体；将该重组腺病毒表达载体转染包装细胞—人胚肾293细胞得到重组腺病毒，重组腺病毒体外感染哺乳动物细胞可使目的细胞具有免疫抑制作用。本发明将在医学领域，尤其是器官移植领域中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N7/01GK101343640SQ20081005675
公开日2009年1月14日 申请日期2008年1月24日 优先权日2008年1月24日
发明者王韫芳, 管利东, 罗海英, 翟树森, 裴雪涛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所