用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体的制作方法

专利名称：用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组载体领域，主要是一种用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体。
背景技术：
类风湿关节炎是一种常见的自身免疫性疾病，好发于年轻女性，晚期可引起关节强直、畸形和功能严重受损，给病人和家庭带来极大痛苦，从而严重影响生产劳动、经济建设和生活质量。我省是类风湿关节炎高发省，类风湿关节炎患者众多，给患者的生活及工作带来极大的损害。目前类风湿关节炎发生发展的内在机制尚未完全明了，临床上也无特效疗法，治疗原则主要在于控制炎症、缓解症状、控制病情进展、防止关节功能破坏等。
随着分子生物学和免疫学的进展，类风湿关节炎动物模型的建立，发现T淋巴细胞亚群比例失调，尤为Th1/Th2及其分泌的细胞因子间不平衡，信号传导表达异常和促炎性细胞因子与抑炎性细胞因子间的不平衡等在类风湿关节炎发病过程中起重要作用。
正常人的Th1/Th2细胞及其分泌的细胞因子在体内处于动态平衡状态，这种平衡对维持机体的免疫自稳起着重要作用。许多研究表明，Th1/Th2细胞及其分泌细胞因子的失衡与类风湿关节炎发病机制密切相关。Elewaut等研究表明，在类风湿关节炎关节滑膜液，单个核细胞中Th1细胞及其分泌的细胞因子占绝对优势，且Th1/Th2细胞的比值明显升高，与血沉和C反应蛋白呈正相关。Yudoh K等研究认为，促炎性Th1细胞及其分泌的和抗炎性Th2细胞及其分泌的IL-4的失衡，在类风湿关节炎发病机制中具有重要作用。动物实验证明，通过下调Th1或上调Th2细胞反应，可抑制RA病程的发展，从而起治疗和保护作用。
类风湿关节炎的滑膜细胞大量产生各种炎性因子，可能与炎症迁延、滑膜细胞活化、增殖及骨损害等有关。环氧化酶-2(COX-2)是炎症过程中一个重要的诱导酶，并参与细胞生长、代谢、肿瘤发生等。类风湿关节炎病人关节滑膜细胞过度增生可能与COX-2基因过度活跃有关，从而抑制了细胞凋亡。国内外众多学者应用非甾体类药物选择性地抑制关节滑膜细胞分泌的COX-2活性，以抑制细胞的过度增殖，促进细胞凋亡，从而抑制关节炎的发生、发展。
NO是一种细胞间信使分子，与自身免疫病的发生有关。IL-1β、TNF-α、IFN-γ等细胞因子可促进iNOS的合成。在用II型胶原和佐剂复制的关节炎小鼠或自然发生类风湿关节炎样关节炎的小鼠，其关节NO产生亢进，给予iNOS阻断剂可抑制关节炎的产生。
核因子NF-κB是能调节多种炎症和免疫基因表达，普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，在胞内它与NF-κB抑制蛋白(IKB)结合呈非活性状态，一旦被炎症因子、氧化剂等刺激剂激活后，便可与IKB解离转入核内与特异的启动子结合，调控基因的表达。已有研究表明，类风湿关节炎的发生与NF-κB过度激活有关。NF-κB激活后可引起许多慢性炎症性疾病的炎症蛋白表达，诱导炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ等)及炎性酶(iNOS、COX-2等)转录，从而参与类风湿关节炎的病理过程。
有研究表明，类风湿关节炎(RA)的关节滑膜组织环氧化酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)过度表达及其诱导产物PGE2、NO的大量合成，炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IL-18等过度产生，引起大量炎症细胞浸润、滑膜组织异常增生、新生血管翳形成，最终导致关节肿胀、退变。
IL-18是新近发现的前炎症因子，其重要的生物学功能是诱导Th1细胞产生相应的细胞因子，如强烈诱导IFN-γ和其它炎症细胞因子(TNFα、IL-1β等)及趋化因子的产生，研究表明，IL-18参与类风湿关节炎发生发展的病理过程。白细胞介素-18结合蛋白(IL-18BP)是IL-18活性的天然拮抗剂，通过与IL-18特异结合而抑制IL-18的活性，进而抑制促炎因子TNFα、IL-1β、IFN-γ等的产生。已有学者用于治疗动物类风湿关节炎模型，能明显缓解疾病。IL-4是典型的Th2细胞因子，具有调节Th1/Th2平衡及抗炎作用。动物实验表明，应用IL-4重组蛋白或重组腺病毒治疗胶原诱导的关节炎小鼠，已取得明显的疗效。我们利用RT-PCR技术获得小鼠IL-18BP及IL-4全长cDNA，通过通用直链氨基酸接头(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3将两个cDNA片段连接后，定向插入Adeno-X腺病毒表达载体，构建稳定表达IL-18 BP/IL-4融合蛋白的重组腺病毒。将此重组腺病毒局部注射治疗胶原诱导的小鼠RA模型，通过在体内持续表达的重组IL-18 BP/IL-4融合蛋白来诱导及上调机体Th2反应，抑制滑膜细胞NF-κB活性，进而抑制关节局部前炎症介质COX-2和iNOS表达及其诱导产物PGE2和NO的合成，并抑制炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IL-18的产生，发挥抗类风湿关节炎的作用。

发明内容
本发明的目的正是为了克服现有技术的不足，而提供一种用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体。
本发明解决其技术问题采用的技术方案这种用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体，主要包括以下步骤1)、将小鼠脾细胞RNA逆转录成为cDNA后，用高保真聚合酶扩增出IL-18BP，IL-4基因序列，并用通用直链氨基酸接头(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3将IL-18BP与IL-4两个基因连接后，构建成IL-18BP与IL-4融合基因；2)、将IL-18BP与IL-4融合基因和AdEasy系统中的穿梭载体pShuttle-CMV(PSC)质粒用BglII和HindIII双酶切后利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接产物PSC-IL-18BP/IL-4；3)、将连接产物PSC-IL-18BP/IL-4和对照质粒PSC-LacZ电转化入BJ5183-AD-1感受态细菌中后获得AD-IL-18BP/IL-4和AD-LacZ对照腺病毒载体质粒；4)、扩增经鉴定正确的腺病毒载体质粒，用PacI酶切纯化后，应用MBS转染试剂盒将质粒转入50％-70％融合的AD293细胞中，当出现细胞病变效应时，收获细胞及培养上清，-70℃～37℃反复冻融3次，剧烈振荡后离心收集上清感染AD-293细胞，-70℃备用。
本发明中将连接产物PSC-IL-18BP/IL-4转化至DH5a感受态细菌中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育过夜，挑取克隆，扩增，抽提质粒并经PCR、酶切及测序鉴定；将正确质粒用PmeI酶切线性化，然后用电转化的方法将穿梭载体转入BJ5183-AD-1感受态细菌(包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育过夜；挑取克隆，扩增，抽提质粒称为AD-IL-18BP/IL-4，质粒并经PCR、酶切鉴定，同时构建对照腺病毒载体质粒AD-LacZ。
本发明中可以用原代病毒上清继续感染AD293细胞，形成第二代病毒。
本发明的有益效果是目前类风湿关节炎尚缺乏特效的药物治疗，我们构建能稳定高效表达具有生物学活性的IL-18BP/IL-4融合蛋白的重组腺病毒，用此重组腺病毒治疗小鼠类风湿关节炎，可缩短类风湿关节炎病程，抑制关节炎病变，减轻关节炎症程度，发挥抗类风湿关节炎的作用，这将为类风湿关节炎基因治疗的临床应用提供实验和理论依据，也为临床对类风湿关节炎防治增加一种新手段，相信不久将来基因治疗将成为临床抗类风湿关节炎的一种重要选择。同时构建IL-18BP/IL-4融合表达载体，具有更强的诱导机体Th2反应的作用，因此除用于本研究的抗类风湿关节炎基因治疗外，尚可用于其它由于Th1/Th2比例失调，尤其是Th1类细胞因子过度表达而Th2类细胞因子相对不足的自身免疫性疾病。此外，还可与疫苗共同注射，通过诱导机体Th2反应，促进保护性抗体的产生，增强疫苗的效果。因此，具有良好的应用前景和开发价值。


图1是本发明的技术线路示意图；图2是本发明的重组腺病毒载体构建示意图；具体实施方式
下面结合附图和具体方式对本发明作进一步详细的说明。
这种用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体，主要包括以下步骤1)、将小鼠脾细胞RNA逆转录成为cDNA后，用高保真聚合酶扩增出IL-18BP，IL-4基因序列，并用通用直链氨基酸接头(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3将IL-18BP与IL-4两个基因连接后，构建成IL-18BP与IL-4融合基因；2)、将IL-18BP与IL-4融合基因和AdEasy系统中的穿梭载体pShuttle-CMV(PSC)质粒用BglII和HindIII双酶切后利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接产物PSC-IL-18BP/IL-4；3)、连接产物PSC-IL-18BP/IL-4转化至DH5a感受态细菌中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育过夜，挑取克隆，扩增，抽提质粒并经PCR、酶切及测序鉴定；将正确质粒用PmeI酶切线性化，然后用电转化的方法将穿梭载体转入BJ5183-AD-1感受态细菌(包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育过夜；挑取克隆，扩增，抽提质粒称为AD-IL-18BP/IL-4，质粒并经PCR、酶切鉴定，同时构建对照腺病毒载体质粒AD-LacZ。
4)、扩增经鉴定正确的腺病毒载体质粒，用PacI酶切纯化后，应用MBS转染试剂盒将质粒转入50％-70％融合的AD293细胞中，当出现细胞病变效应时，收获细胞及培养上清，-70℃～37℃反复冻融3次，剧烈振荡后离心收集上清感染AD-293细胞，-70℃备用，可以用原代病毒上清继续感染AD293细胞，形成第二代病毒。
一、材料、试剂和仪器设备
(一)动物Balb/c小鼠雄性，6周龄，重18g，健康，购自浙江大学动物中心。
(二)质粒和菌种1、p-Shuttle-CMV质粒(以下简称PSC)为穿梭载体，7.4kb，含有CMV启动子及卡那霉素抗性的质粒，能容受6.6kb的外源基因，购自美国stratagene公司，货号240007。
2、pAdEasy-1质粒为腺病毒5型骨架质粒，33.5kb，具有氨苄青霉素抗性，含有pBR322复制起始子、重组左臂、重组右臂。E1，E3基因缺失，购自美国stratagene公司，货号200157。
3、p-shuttle-CMV-LacZ质粒(以下简称PSC-LacZ)为外源基因重组腺病毒产物的对照质粒，10.6kb，购自美国stratagene公司，货号240008。
4、BJ5183-AD-1电转化感受态细菌细菌内含有pAdEasy-1腺病毒骨架质粒，购自美国stratagene公司，货号200157。
5、转化对照质粒为细菌BJ5183-AD-1作电转化效率的对照，购自美国stratagene公司。
6、XL-10Gold超感受态细菌购自美国stratagene公司，货号200314。
7、pUC18对照质粒为高考贝质粒，作为XL-10Gold感受态细菌转化效率的对照质粒，购自美国stratagene公司。
8、大肠杆菌E coliDH5a，购自美国invitrogen公司(三)细胞株AD293购自美国Stratagene公司。来源于人胚胎肾细胞，经腺病毒基因转化，贴壁性较好，货号240085。
(四)试剂1、实验试剂一般试剂(1)Pyrobest高保真DNA聚合酶(5U/μl)日本Takara，共含125U pyrobest、500μl 10×M buffer，货号DR005A。
(2)Advangtage×2 PCR kit(5U/μl)美国Clontech公司，其聚合酶具有70％的保真性。货号639206。
(3)TaqPlus DNA聚合酶(2.5U/μl)北京鼎国，共含1000U聚合酶，5000μl 10×buffer。
(4)限制性内切酶BgLII日本Takara，共含500U内切酶，500μl 10×H buffer，10×loading buffer，货号D1021A。
(5)限制性内切酶HindIII日本Takara，共含500U内切酶，500μl 10×H buffer，10×loading buffer，货号D1060A。
(6)限制性内切酶10×K buffer日本Takara，200mM Tris-HCL PH8.5，100Mm Mgcl2，10mM Dithiothreitol，1000mM氯化钾。
(7)限制性内切酶PmeI(10U/μl)英国NEB公司，共含250U内切酶，500μl 10×NEBuffer4，500μl 100×BSA，货号R0560V。
(8)限制性内切酶PacI(10U/μl)英国NEB公司，共含125U内切酶，500μl 10×NEBuffer1，500μl 100×BSA，货号R0547V。
(9)T4 DNA ligase(3U/μl)美国Promega，共含100U连接酶，500μl 10×buffer，货号M1801A。
(6)Trizol Reagent美国Invitrogen，共含100ml超纯Trizol液，货号15596-026。
(7)M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μl)美国Gibcol，共含4000U逆转录酶，1000μl 10×buffer，500μl 100nM DTT，货号28025-013。
(8)DNA分子量Marker(Lamda/HindIII)立陶宛MBI Fermentas，分子量条带为23130bp、9416bp、6857bp、4361bp、2032bp、2027bp、564bp，货号SM102。
(9)DNA分子量Marker上海博亚生物公司，分子量条带为7000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、500bp。
(10)6×DNA Loading Buffer立陶宛MBI Fermentas。
(11)10×dNTPs混合液立陶宛MBI Fermentas。
(12)溴化乙锭(EB)德国Boehringer Mannheim公司。用水配成1％浓度，避光保存。
(13)IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)美国Promega。
(14)X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)美国Promega，溶于二甲基甲酰胺40mg/ml。
(15)蛋白胨500g，英国OXIOD公司产品，含总氮12.7g，货号G217。
(16)酵母提取粉500g，英国OXIOD公司产品。
(17)细菌用琼脂100g，英国OXIOD公司产品。
(18)Ampicillin10g，Amresco，贮存浓度100mg/ml，使用浓度100μg/ml。
(19)Kanamycin1g，Amresco，贮存浓度50mg/ml，使用浓度50ngml，货号0408。
(20)β-巯基乙醇(β-ME)50μl，购自美国stratagene公司，货号200314。
(21)氯喹购自美国stratagene公司，货号402346/1 50203078。
(22)NZY(细菌培养基添加粉)500g，含游离氨基酸＜54％，总氮≥11.0％，货号G211。
(23)StrataPrepPCR purification kit美国stratagene公司，货号400771。
(24)EDTA100g，购自上海生工生物工程公司，Amresco分装，货号0928A61。
(25)SDS100g，购自上海生工生物工程公司，Amresco分装，货号S0485。
(26)氛氯仿100ml，购自上海生工生物工程公司，货号D0419。
(27)小量超纯质粒DNA抽提试剂盒(细胞转染用)上海博亚生物有限公司。
(28)SSCS感受态细菌制备试剂盒购自上海生工生物工程公司，含SSCS溶液25ml，货号SK2301。
(29)琼脂糖粉100克/瓶，西班牙Biowest公司产品，货号GI-241100。
(30)MAX Efficiency DH5a Competent Cells美国invitrogen公司，货号18258-012。
(31)MBS Mammalian Transfectin Kit美国stratagene公司，包括溶液I、II、III。货号200388。
(32)寡核苷酸引物合成主要由上海生物工程公司完成。
细胞培养用试剂(1)DMEM细胞培养基美国Gibco公司产品。
(2)RPMI-1640细胞培养基美国Gibco公司产品。
(3)胎牛血清(FCS)美国Hyclone公司和杭州四季青产品。
(4)胰蛋白酶(Trypsin)美国Gibco公司产品；用D-Hanks液配制0.25％胰酶，过滤除菌后加高压灭菌的EDTA至终浓度为0.02％，作为细胞消化液。
2、溶液配制(1)LB液体细菌培养基蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，加水至1L，NaOH调pH至7.4，分装，高压蒸汽灭菌20min。
(2)LB固体细菌培养基在LB液体细菌培养基中加入细菌用琼脂15g/L，分装，高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃，加卡那霉素至终浓度5μg/ml，平铺90mm直径培养皿。
(3)20％IPTGIPTG 2g，溶解于10ml水中，0.22μm滤器过滤除菌。
(4)5×TBETris碱54g，硼酸27.5g，0.5M EDTA(pH8.0)20ml，加水至1L，使用浓度为0.5×TBE。
(5)溶液I含50mmol/L葡萄糖、25mmol/Ltris碱(PH8.0)、10mmol/L EDTA(PH8.0)，成批配制，每瓶100ml，高压蒸汽灭菌15分钟。
(6)溶液II配制0.4mol/L NaOH、2％SDS溶液，用前根据需要量在容器内加入一半0.4mol/LNaOH，一半2％SDS溶液。终浓度为0.2mol/LNaOH、1％SDS溶液。
(7)溶液III100ml中含60ml 50mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5ml三蒸水，所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
(五)材料1、60mm细胞培养皿、一次性滤器(0.22μm孔径)美国BD Falcon公司。
2、无RNA酶微量离心管美国Porex生物产品公司。
3、电转化杯沟宽2mm，总体积400μl，美国eppendorf公司，货号Eppendorf#4307-000-593。
(六)设备1、超净工作台美国Forma Scientific公司，Class IIA/B3型2、电转化仪美国Bio-RAD公司3、扫描仪Epson公司4、数码摄像机德国Leica，TCS-NT型5、温度梯度PCR仪英国Hybaid，LifeExpress6、普通PCR仪PERKIN ELMEM，型号96007、凝胶数字成像系统美国Alpha Innotech，IS-1000型8、紫外检测仪温州医疗仪器厂，KNT-1型9、紫外分光光度仪美国Pharmacia Biotech公司，Gene Quant II型10、电热恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司DK-8A型11、电热恒温水槽上海医用恒温设备厂DK-8D型12、恒温摇床江苏太仓实验设备厂，TH2-C型13、纯水器美国MILIPORE公司14、旋涡震荡器上海亚荣生化仪器厂WH-90A型15、高速冷冻离心机德国Heraeus公司，400R型
16、普通离心机北京医用离心机厂LD25-2型17、PH计美国Beckman公司18、电子精密天平瑞士METTLER公司，AE200型19、恒流恒压电泳仪美国Bio-RAD公司20、-80℃超低温冰箱美国Thermo Forma公司21、4℃冰箱伊莱克斯BCD-277型22、倒置显微镜日本Olympus TMT2-21型23、置相差显微镜日本Olympus CK40型二、方法(如图1所示)(一)设计和制备引物、PCR模板及扩增基因序列1、根据美国NIH(National institute of Health)Nucleotide提供的序列设计引物。
IL-18BP上游引物P15’-GCAGATCTATGACCATGAGACACTGCTG-3’下游引物P25’-TGCAACCCCTGGGCCTGCTG-3’IL-4上游引物P15’-ATGGGTCTCAACCCCCAGCT-3’下游引物P25’-CGAAGCTTCTACGAGTAATCCATTTGC-3’IL-18BP上游引物5’端包含BglII酶切序列AGATCT，IL-4下游引物5’端包含HindIII酶切序列AAGCTT。
直链氨基酸接头(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3序列(linker primer)5’-ggcccaggggttgca GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGT GGA TCT GGT GGCGGC GGA TCT atgggtctcaacccc-3’5’端和3’端小写序列分别为IL-18BP结尾及IL-4起始序列。
2、制备PCR模板将小鼠用氯氨酮全身麻醉后剖开腹部取出脾脏，立即冻入液氮中。提取RNA步骤如下(1)取约100mg脾脏组织，放入用液氮预冷的研钵中，研磨至粉末。
(2)加1ml Trizol Reagent入研钵中，待其化成液体并与组织粉末充分混合后，吸入eppendorf管(简称ep管)中。
(3)冰上放置5min，加200μl氯仿，混匀，冰上静置15min。
(4)于4℃ 12000rpm，15min。
(5)吸取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，冰上静置10min。
(6)于4℃12000rpm，10min。
(7)去上清，加入75％DEPC水配制的乙醇，4℃放置2h。
(8)于4℃12000rpm，5min。
(9)弃上清，真空抽干机抽干，加入20μl无菌DEPC水，充分混匀，置冰上取2μl电泳。
(10)将RNA逆转录成cDNA，体系与条件如下RNA 2μlOligdT18 1μl(50pmol/μl)DEPC H2O7μl共10μl→70℃ 5min↓置冰上2min↓于4℃3000rpm 15sec再在管中加入以下体系5×MMLV buffer 4μl100nM DTT 2μl10×dNTP 0.5μlMMLV 0.5μlDEPC H2O 3μl共20μl体系↓42℃水浴1h↓4℃3000rpm 15sec，70℃水浴 10min(11)扩增IL-18BP和IL-4基因序列①用高保真Taq酶(pyrobest)分别扩增IL-18BP和IL-4基因片段。
PCR反应体系10×PCR reaction buffer 5μl10×dNTP mix 1μl40pM Primer 10.5μl40pM Primer 20.5μlcDNA 2μlTaq(5U/μl) 1μlddH2O(无菌三蒸水) 40μlTotal Volume 50μlPCR反应条件 94℃ 3min 1 cycle94℃ 30sec58℃ 30sec72℃ 1min 35 cycles72℃ 7min 1 cycle②取5μl扩增产物，在1％琼脂糖凝胶中电泳证实有预期长度片段后将PCR产物用StrataPrepPCR purification kit纯化，最后得20μl纯化产物。
③以纯化产物为模板，再以高保真酶扩增IL-18BP/IL-4融合基因片段。
PCR反应体系10×PCR reaction buffer 20μl10×dNTP mix 4μl40pM IL-18BP P1 2μl40pM IL-4 P2 2μl40pM Linker primer 2μl纯化产物(IL-1 8BP和IL-4)各 1μlPyrobest Taq(5U/μl) 2μlddH2O 166μlTotal Volume 200μl
PCR反应条件94℃ 3min68℃ 10min 1 cycle94℃ 30sec60℃ 30sec72℃ 1.5min 35 cycles72℃ 10min 1 cycle④取2μl扩增产物，在1％琼脂糖凝胶中电泳证实有预期长度片段(1050bp左右)后，余产物进行割胶纯化，用QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化，最后得25μl产物。
(二)构建PSC-IL-18BP/IL-4穿梭载体1、用BgLII和HindIII双酶切PSC质粒和IL-18BP/IL-4融合基因PCR纯化物。
酶切反应体系AIL-18BP/IL-4 fragment 20μlHindIII(10U/μl)2μlBgLII(10U/μl) 2μl10×K buffer4μlddH2O12μlTotal Volume40μl酶切反应体系BPSC 20μlHindIII(10U/μl)4μlBgLII(10U/μl) 4μl10×buffer 8μlddH2O44μlTotal Volume80μl置37℃水浴2h后，各取3μl电泳，确证pShuttle-CMV完全线性化，余酶切产物用StrataPrepPCR purification kit纯化，最后各以20μl水洗脱DNA，再行连接反应。
连接反应体系 线性化PSC 1μl酶切后IL-18BP/IL-4 fragment 0.5μlT4 Ligase(3U/μl) 1μl
10×buffer 1μlddH2O 6.5μlTotal Volume 10μl室温反应2h，然后4℃过夜，获得重组PSC-IL-18BP/IL-4穿梭载体。
2、感受态细菌制备(1)从LB平板上挑取单菌落DH5a，接种于5ml液体LB，37℃振摇培养过夜。
(2)吸取0.4ml培养菌液接种于40ml液体LB，37℃振摇培养3h，置冰浴10min。
(3)于4℃4000rpm离心10min，弃去上清。
(4)以5ml冰预冷CaCl2(0.1M)重悬细菌，置冰浴30min。
(5)于4℃ 4000rpm离心10min，弃去上清。
(6)加1ml冰预冷CaCl2(0.1M)重悬细菌，分装暂存4℃。
3、PSC-IL-18BP/IL-4重组质粒及对照质粒PSC-LacZ的转化(1)取10μl连接产物及1μl对照质粒加入100μl感受态细菌，混匀后冰浴30min。
(2)换置42℃水浴90sec，再置冰浴2min。
(3)加入1ml液体LB，37℃ 200rpm振摇培养1h。
(4)于4℃ 4000rpm离心5min，弃去上清。
(5)加100μl液体LB重悬转化菌液，均匀涂在含有卡那霉素的固体LB平板(对照质粒用平板事先涂IPTG和X-gal)上，37℃培养18h。
4、阳性克隆的筛选和鉴定(1)阳性克隆的筛选重组质粒经卡那霉素抗性、对照质粒经卡那霉素和蓝白菌落初步筛选后，重组质粒挑取10个中等大小白色生长单菌落、对照质粒挑选2个蓝色单菌落接种于3ml液体LB(含有卡那霉素50mg/ml)，37℃振摇培养12h。用小量超纯质粒DNA抽提试剂盒提取质粒DNA，最后溶解在30μl无菌水中。
(2)重组质粒酶切法鉴定用HindIII和BgLII双酶切5μl重组质粒DNA，酶切后产物取7.5μl于1％琼脂糖凝胶中电泳，有1100bp左右插入片段释放出者视为阳性重组体。
酶切反应体系PSC-IL-18BP/IL-4质粒DNA5μlBgLII 0.5μlHindIII0.5μl10×K buffer 2μl
ddH2O 12μlTotal Volume 20μl反应条件37℃水浴2h。
(3)PCR法鉴定取0.5μl重组质粒DNA，用PCR法扩增插入片段。扩增产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，有1050bp左右片段产物者视为阳性重组体。
PCR反应体系10×PCR reaction buffer 2.5μl10×dNTP mix0.5μl40pM IL-18BP P1 0.5μl40pM IL-4 P20.5μlPSC-IL-18BP/IL-40.5μlTaq(5U/μl) 0.3μlddH2O20.2μlTotal Volume25μlPCR反应条件同pyrobest高保真酶扩增的反应条件。
(4)测序鉴定将10μl上下游引物及10μl重组质粒送至上海博亚基因公司进行序列鉴定。
(三)AD-IL-18BP/IL-4与AD-LacZ的构建1、PmeI酶切使PSC-IL-18BP/IL-4和PSC-LacZ线性化酶切反应体系APSC-IL-18BP/IL-4质粒DNA 22μlPmeI 4μl10×NEBuffer4 20μl100×BSA 2μlddH2O 152μlTotal Volume 200μl反应条件37℃水浴4h。
酶切反应体系BPSC-LacZ质粒 22μl
PmeI 4μl10×NEBuffer4 20μl100×BSA 2μlddH2O 152μlTotal Volume 200μl酶切反应条件37℃水浴4h各取3μl 1％琼脂糖凝胶电泳，确证PSC-IL-18BP/IL-4及PSC-LacZ已完全线性化，余酶切产物用StrataPrepPCR purification kit纯化，最后各以20μl水洗脱DNA，再行电转化。
2、电转化(在杭州九源基因公司完成)(1)准备在-20℃预处理电转杯、在冰上融化BJ5183-AD-1感受态细菌、37℃预温2ml液体LB、预冷2支1.5ml ep管。
(2)设定电转仪电压 2.5KV电容 25μF电阻 200Ω(3)取2μl已纯化好的酶切产物，分别放入预冷的1.5ml ep管中，再加40μlBJ5183-AD-1，混匀，并将混合物注入预冷的电转杯中。
(4)电转化将电转杯插入电击通道，按下按钮，时间分别是PSC-IL-18BP/IL-4 4.62ms，PSC-LacZ 4.66ms。
(5)在电击后的电转杯中加入预温的200μl LB，充分混匀，将其吸出至余下的800μl LB中。
(6)37℃ 225rpm振摇1h。
(7)取50μl菌液均匀涂于含卡那霉素(50mg/ml)的平板上，37℃孵育过夜。
(8)余下菌液3000rpm 10min，去除上清，加入100μl LB重悬细菌，混匀后均匀涂于含卡那霉素的平板上，37℃孵育过夜。
3、阳性重组腺病毒载体质粒的鉴定(1)阳性克隆的筛选AD-IL-18BP/IL-4重组子经卡那霉素抗性、AD-LacZ质粒经卡那霉素和蓝白菌落初步筛选后，AD-IL-18BP/IL-4挑取10个中、小白色生长单菌落、AD-LacZ挑取10个中、小蓝色单菌落接种于3ml液体LB(含有卡那霉素50mg/ml)，37℃振摇培养8h，再加入17ml含卡那霉素的LB，37℃振摇培养16h。
(2)用碱裂解法中量抽提重组腺病毒质粒DNA①将9ml振摇过夜的细菌于4℃ 12000rpm 1min，去尽上清。
②用100μl溶液I重悬细菌沉淀，剧烈振荡混匀。
③加入200μl新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒5次，以混合内容物。将ep管冰上放置5min。
④加入150μl溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10sec，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上5min。
⑤于4℃ 12000rpm 8min，将上清转移到另一1.5ml ep管中。加等体积氛氯仿，振荡混匀，于4℃ 12000rpm 2min，将上清转移至另一1.5ml ep管中。
⑥2倍体积的无水乙醇于室温沉淀DNA。振荡混匀，于室温放置2min。
⑦4℃ 12000rpm 5min。
⑧去上清，用1ml 70％乙醇于于4℃洗涤DNA沉淀，去上清。
⑨4℃ 12000rpm 5min。
⑩真空抽干机于35℃3min，用35μl ddH2O溶解质粒，加入1μl RNA酶，55℃水浴10min。
(3)将抽提得到的质粒分别转化入普通DH5a感受态细菌和XL10-Gold感受态细菌中。DH5a作为对照(与XL10-Gold细菌相比观察重组腺病毒质粒在DH5a细菌中的扩增效率)。转化DH5a细菌的步骤与前相同。转化XL10-Gold感受态细菌步骤与普通DH5a感受态细菌基本相同，除了XL10-Gold细菌在质粒感受态细菌混合物中加入的LB培养基中含有NZY，而普通DH5a感受态细菌与质粒混合物加入的LB中没有。
(4)0.75％凝胶电泳显示AD-IL-18BP/IL-4与Lamda/HindIII Marker比较，主要片段在23kb以上者作PacI单酶切、BgLII和HindIII双酶切及PCR鉴定；AD-LacZ只作PacI酶切鉴定。
(5)重组腺病毒质粒酶切法鉴定用HindIII和BgLII双酶切7μl重组腺病毒质粒DNA，酶切后产物取8μl于0.75％琼脂糖凝胶中电泳，有1050bp左右有片段释放出者视为阳性重组体。PacI酶切7μl重组腺病毒质粒，酶切后取8μl于0.75％琼脂糖凝胶中电泳，若有4.5kb或3.0kb片段释放出者视为阳性重组体。
双酶切反应体系AD-IL-18BP/IL-4质粒 7μlBgLII 0.5μlHindIII 0.5μl10×K buffer2μlddH2O10μlTotal Volume20μl反应条件37℃水浴2h。
PacI酶切体系AD-IL-18BP/IL-4质粒 7μl10×NEBuffer1 2μl100×BSA 0.2μlPacI 0.3μlddH2O 10.5μlTotal Volume 20μl反应条件37℃水浴2h。
(6)PCR法鉴定取1μl重组AD-IL-18BP/IL-4，用PCR法扩增插入片断。扩增产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，有1050bp左右片段产物者视为阳性重组体。
PCR反应体系10×PCR reaction buffer2.5μl10×dNTP mix 0.5μl40pM IL-18BP Primer1 0.5μl40pM IL-4 Primer2 0.5μlAD-IL-18BP/IL-4质粒1μlTaq(5U/μl)0.3μlddH2O 19.7μlTotal Volume 25μlPCR反应条件与pyrobest高保真酶的反应条件相同。
4、IL-18BP/IL-4重组腺病毒载体质粒包装及第二代感染病毒的初步鉴定(1)IL-18BP/IL-4重组腺病毒载体质粒在AD293细胞中的包装细胞培养和铺种AD293细胞用含有10％FCS的DMEM培养传代。复苏后细胞传至3～20代用于转染实验。转染前细胞用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化细胞，计数后在60mm培养皿上接种1～2×105/孔，于37℃、5％CO2孵箱中培养24h以上，细胞生长达50％-70％融合率用于转染。
(2)质粒DNA细胞转染①用不含血清的DMEM洗涤60mm培养皿中细胞2次。
②加入4ml含MBS溶液III及0.1％氯喹的无血清DMEM，37℃孵育20-30min。
③将5μg重组质粒溶解在225μl纯净水中，加入25μl MBS溶液I，轻轻混匀。
④加入250μl MBS溶液II混匀，室温10min后添加入培养皿细胞内。
⑤于37℃、5％CO2孵箱中继续培养3h，再换为含有10％FCS及0.1％氯喹的DMEM4ml继续培养，7h后换成含10％FCS的完全DMEM培养基中。
⑥包装期间每隔3-4天换用新鲜完全培养基。
⑦在包装至13天时收获病毒，-70℃-37℃反复冻融3次，剧烈振荡。
⑧4℃，12000rpm，10min。取上清-70℃备用，为原代病毒。
(3)用原代病毒感染AD293细胞，获取第二代病毒。
将原代病毒上清加入小体积培养基培养的AD293细胞中，于37℃、5％CO2孵箱孵育2h，添加培养基至一般培养的培养基量。第三天收获病毒，步骤同原代病毒包装细胞。
研究结果一、小鼠IL-18BP和IL-4基因片段的扩增将获取的总RNA逆转录成为cDNA，应用特异引物及高保真聚合酶扩增。1％琼脂糖凝胶电泳显示，与Marker比较，获得特异性条带IL-18BP(580bp左右)，IL-4(430bp左右)，IL-18BP/IL-4融合基因片段(1050bp左右)。
二、构建成功PSC-IL-18BP/IL-4穿梭载体质粒及其鉴定结果通过BglII、HindIII双酶切IL-18BP/IL-4 PCR扩增片段及PSC空载体，纯化、回收，再由T4 DNA连接酶连接。反应一段时间后将连接产物转化入DH5a感受态细菌中，37℃孵育过夜，挑取阳性克隆。而对照PSC-LacZ通过IPTG诱导分解X-gal产生蓝色菌落。扩增PSC-IL-18BP/IL-4阳性克隆，通过PCR、双酶切鉴定与原始PCR产物相比在相应位置都有同等大小片段，测序结果则显示插入片段为正确的IL-18BP/IL-4融合基因序列。
测序结果如下测序结果与Nucleotide中所提供的序列在DNAssist 2.0软件上分析比对，将测序结果在此软件上翻译成蛋白序列，比较没有发现氨基酸突变。
核酸序列atgaccatg agacactgct ggacagcagg ccccagttct tggtgggtcc tgcttttgta tgtccatgtcattttggcca gagccacatc tgcacctcag acaactgcca ctgtcttaac tggaagctca aaagacccatgctcttcctg gtctccagca gtcccaacta agcagtaccc agcactggat gtgatttggc cagaaaaagaagtgccactg aatggaactc tgaccttgtc ctgtactgcc tgcagccgct tcccctactt cagcatcctctactggctgg gcaatggttc cttcattgag cacctcccag gccggctgaa ggagggccac acaagtcgcgagcacaggaa cacaagcacc tggctgcaca gggccttggt gctggaagaa ctgagcccca ccctacgaagtaccaacttc tcctgtttgt ttgtggatcc tggacaagtg gcccagtatc acatcattct ggcccagctctgggatgggt tgaagacagc tccgccccct tctcaagaaa ccctctctag ccacagccca gtatccagatcagcaggccc aggggttgca GGT GGC GGT GGATCC GGC GGT GGT GGA TCT GGT GGC GGC GGA TCT at gggtctcaac ccccagctagttgtcatcct gctcttcttt ctcgaatgta ccaggagcca tatccacgga tgcgacaaaa atcacttgagagagatcatc ggcattttga acgaggtcac aggagaaggg acgccatgca cggagatgga tgtgccaaacgtcctcacag caacgaagaa caccacagag agtgagctcg tctgtagggc ttccaaggtg cttcgcatattttatttaaa acatgggaaa actccatgct tgaagaagaa ctctagtgtt ctcatggagc tgcagagactctttcgggct tttcgatgcc tggattcatc gataagctgc accatgaatg agtccaagtc cacatcactgaaagacttcc tggaaagcct aaagagcatc atgcaaatgg attactcgta g蛋白序列MTMRHCWTAGPSSWWVLLLYVHVILARATSAPQTTATVLTGSSKDPCSSWSPAVPTKQYPALDVIWPEKEVPLNGTLTLSCTACSRFPYFSILYWLGNGSFIEHLPGRLKEGHTSREHRNTSTWLHRALVLEELSPTLRSTNFSCLFVDPGQVAQYHIILAQLWDGLKTAPPPSQETLSSHSPVSRSAGPGVA(G-G-G-G-S)3MGLNPQLVVILLFFLECTRSHIHGCDKNHLREIIGILNEVTGEGTPCTEMDVPNVLTATKNTTESELVCRASKVLRIFYLKHGKTPCLKKNSSVLMELQRLFRAFRCLDSSISCTMNESKSTSLKDFLESLKSIMQMDYS三、构建完成IL-18BP/IL-4重组腺病毒质粒(ADIL-18BP/IL-4)与LacZ重组腺病毒质粒(AD-LacZ)并鉴定其正确性。
1、酶切及电转化结果PSC-IL-18BP/IL-4、PSC-LacZ经PmeI酶切完全线性化，纯化回收。取200ng回收产物与BJ5183-AD-1电转化感受态细菌混合，并进行电转化，经37℃孵育过夜获得克隆平板。ADIL-18BP/IL-4质粒为白色透明菌落，按照单克隆直径大小大致分为大、中、小克隆。AD-LacZ质粒为蓝色菌落。
2、重组腺病毒质粒鉴定结果AD-IL-18BP/IL-4质粒挑选平板上最小类型的克隆，扩增并抽提质粒，凝胶电泳显示浅淡条带，位置在23kb以上。再分别转化入DH5a感受态细菌和XL10-Gold感受态细菌中孵育并挑取克隆扩增，重组腺病毒质粒在两个不同的感受态细菌中扩增效率相似。抽提质粒，原始PCR产物作为阳性对照，结果PCR，BglII、HindIII双酶切显示都有1050bp左右的条带，PacI酶切显示有4.5kb或者3.0kb的片段释放出来。AD-LacZ质粒挑选平板上蓝色菌落，扩增并抽提质粒，转化入DH5a感受态细菌中孵育并挑取克隆扩增并抽提质粒，PacI酶切显示有4.5kb或者3.0kb的片段释放出来。
3、重组腺病毒质粒在AD293细胞中包装及第二代病毒感染结果当AD293细胞在60mm培养皿中达50％-70％的融合度时，将重组腺病毒质粒转入，10％FCS-DMEM培养，37℃孵育。在培养至第10天时出现局部的细胞病变效应，AD293细胞变圆、胀大并成团或成串脱落。在第13天时90％的细胞出现病变效应，将其吹下，收获，在-70℃-37℃反复冻融3次，离心取上清。一部分上清冻于-70℃备用，一部分上清再次感染AD293细胞，第3～5天时，90％细胞出现病变效应。收获细胞，反复冻融后高速离心，留取离心上清液经0.45um滤器过滤后，于-80℃保存。
权利要求
1.一种用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体，其特征是主要包括以下步骤1)、将小鼠脾细胞RNA逆转录成为cDNA后，用高保真聚合酶扩增出IL-18BP，IL-4基因序列，并用通用直链氨基酸接头(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3将IL-18BP与IL-4两个基因连接后，构建成IL-18BP与IL-4融合基因；2)、将IL-18BP与IL-4融合基因和AdEasy系统中的穿梭载体pShuttle-CMV(PSC)质粒用BglII和HindIII双酶切后利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接产物PSC-IL-18BP/IL-4；3)、将连接产物PSC-IL-18BP/IL-4和对照质粒PSC-LacZ电转化入BJ5183-AD-1感受态细菌中后获得AD-IL-18BP/IL-4和AD-LacZ对照腺病毒载体质粒；4)、扩增经鉴定正确的腺病毒载体质粒，用PacI酶切纯化后，应用MBS转染试剂盒将质粒转入50％-70％融合的AD293细胞中，当出现细胞病变效应时，收获细胞及培养上清，-70℃～37℃反复冻融3次，剧烈振荡后离心收集上清，感染AD-293细胞，-70℃备用。
2.根据权利要求1所述的用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体，其特征是将连接产物PSC-IL-18BP/IL-4转化至DH5a感受态细菌中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育过夜，挑取克隆，扩增，抽提质粒并经PCR、酶切及测序鉴定；将正确质粒用PmeI酶切线性化，然后用电转化的方法将穿梭载体转入BJ5183-AD-1感受态细菌(包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育过夜；挑取克隆，扩增，抽提质粒称为AD-IL-18BP/IL-4，质粒并经PCR、酶切鉴定，同时构建对照腺病毒载体质粒AD-LacZ。
3.根据权利要求1所述的用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体，其特征是用原代病毒上清继续感染AD293细胞，形成第二代病毒。
全文摘要
本发明涉及一种用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体，步骤是1)将小鼠脾细胞RNA逆转录成为cDNA后，用聚合酶扩增出IL－18BP，IL－4基因序列，并用直链氨基酸接头构建成IL－18BP与IL－4融合基因；2)将融合基因和穿梭载体pShuttle－CMV质粒用BglII和HindIII双酶切后利用T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物PSC－IL－18BP/IL－4；3)将连接产物和对照质粒PSC－LacZ电转化入BJ5183－AD－1感受态细菌中后获得AD－IL－18BP/IL－4和AD－LacZ对照腺病毒载体质粒；4)扩增经鉴定正确的腺病毒载体质粒，用PacI酶切纯化后将质粒转入AD293细胞中，当出现细胞病变效应时，收获细胞及培养上清，收集上清感染AD293细胞。本发明的有益效果是用此重组腺病毒治疗，可缩短类风湿关节炎病程，抑制关节炎病变，减轻关节炎症程度，发挥抗类风湿关节炎的作用。
文档编号A61P29/00GK1857738SQ20061005032
公开日2006年11月8日 申请日期2006年4月11日 优先权日2006年4月11日
发明者冷建杭, 姚航平 申请人:杭州市第一人民医院, 浙江大学医学院附属第一医院