专利名称：多肽有机化合物及其在异种移植中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属有机化合物，主要涉及多肽类有机化合物，尤其是关于人工合成的多肽有机化合物及其在异种移植中的应用。
背景技术：
医学技术的进步使人类同种器官移植成为了可能。由于人体器官的来源不足，大量的病人得不到急需的器官，利用猪的器官代替人体器官是目前研究的热点。但由于猪的细胞表面存在异种抗原表位Gal-α-1，3-Gal能与人体内预存的天然抗体结合产生超急性排斥反应，从而导致异种器官移植的失败。人们在努力寻找一种方法可以封闭或清除人天然抗α-Gal抗体，为异种器官移植开辟途径。噬菌体展示技术是一种能够筛选与靶分子结合的特异性多肽的有力工具，已成功运用于抗原表位，特异性受体激动剂或抑制剂和疫苗的研究。在本实验中我们利用噬菌体展示技术，对两种肽库，线性7肽库和C7C文库，进行了亲和筛选。线性7肽库中展示的多肽没有结构限制，具有相对柔性的结构。C7C肽库展示的多肽由于有一对二硫键的限制而形成环状，构象相对稳定。同时采用两种肽库进行筛选，目的在于比较由于结构不同而造成的筛选出的多肽在氨基酸序列上的差异。由于抗B型血单克隆抗体有结合α-Gal抗原表位的特性，因此我们以抗B型血单克隆抗体为靶分子，筛选出能够模拟α-Gal抗原表位的多肽，可以特异地阻断天然抗α-Gal抗体，可以用于异种器官移植超急性排斥反应。
目前临床常用的免疫抑制剂有环孢素A、糖皮质激素、硫唑嘌呤、环磷酰胺等，可以降低整体的免疫反应，但对异种器官移植超急性排斥反应无效，并且有多种副作用，如常见的就有骨髓抑制、肝肾毒性、上消化道出血、脱发等等。我们筛选到的多肽化合物可以特异地阻断异种器官移植超急性排斥反应，但不影响人体的整体免疫反应，可避免常用免疫抑制剂引起的副作用。
发明内容
本发明的目的是克服目前临床上异种器官移植术中出现的排斥反应，设计并提供一种多肽有机化合物。
本发明提供的多肽有机化合物，选自a、b、c、d、e、f、g、h八种中的一种，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。
本发明提供的多肽有机化合物a的氨基酸序列为Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser，分子量为915.96；多肽有机化合物b的氨基酸序列为Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量为963.06；多肽有机化合物c的氨基酸序列为Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量为763.86；多肽有机化合物d的氨基酸序列为Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为963.15；多肽有机化合物e的氨基酸序列为Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为902.07；多肽有机化合物f的氨基酸序列为Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为1031.18；多肽有机化合物g的氨基酸序列为Cys-His-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-Thr-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为987.13；多肽有机化合物h的氨基酸序列为Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为951.14。
本发明的第二个目的是提供多肽有机化合物a、b、c、d、e、f、g、h在制备治疗器官移植术中控制异种移植中超急性排斥反应的药物中的应用。
本发明的优点有①本发明的多肽有机化合物，由于分子组成只有7～9个氨基酸，故可以用人工化学合成方法大量合成，可以得到大量较纯的小肽。
②能与人体内预存的抗猪抗原的抗体特异性结合，从而封闭它的作用，可以抑制猪器官移植至人体时发生的超急性排斥反应。
③本发明的多肽有机化合物与人体内预存的天然抗α-Gal抗体的结合位点是特异性的，正好起到封闭抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
④由于本发明的多肽有机化合物的组成氨基酸数量较少，开发成药物后容易被机体利用而起效。
图1为三种线性多肽与水苏糖竞争性与抗B单克隆抗体结合的ELISA抑制率曲线图。
图2为五种C7C环肽与水苏糖竞争性与抗B单克隆抗体结合的ELISA抑制率曲线图。
图3为多肽化合物抑制人天然抗体引起的猪红细胞的凝集反应结果图。
具体实施例方式
本发明结合以下实施例及附图作进一步说明。
实施例1用抗B型血单克隆抗体作为靶蛋白，用噬菌体展示技术筛选得到阳性噬菌体克隆。
噬菌体展示技术是利用分子生物学技术将合成的一组一定长度的随机序列寡核苷酸片段克隆到特定表达载体中，使其表达产物以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面。由于肽库中包含了该长度小肽的所有可能的氨基酸排列顺序，每一个噬菌体表面蛋白呈现其中的一种肽段，便于筛选；筛选到的噬菌体，可以通过细菌扩增。用噬菌体肽库感染大肠杆菌，使重组入噬菌体的随机的寡核苷酸片段在大肠杆菌内复制，并在噬菌体的外壳蛋白中表达出来。然后，把靶蛋白包被在酶标板上。用此噬菌体肽库与靶蛋白混合后，洗板。如果噬菌体上的外壳蛋白能与靶蛋白结合，就不会被洗掉。最后用酸或亲和洗脱液把噬菌体洗脱下来。连续这样筛3-4轮，就能筛出与靶蛋结合力较强的噬菌体。测此噬菌体的DNA序列得到重组寡核苷酸的序列，亦知道了相应的多肽的序列。然后可通过人工化学合成的方法得到多肽。
本发明提供的多肽有机化合物，包括a、b、c、d、e、f、g、h八种，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。
本发明提供的多肽有机化合物a的氨基酸序列为Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser，分子量为915.96；多肽有机化合物b的氨基酸序列为Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量为963.06；多肽有机化合物c的氨基酸序列为Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量为763.86；多肽有机化合物d的氨基酸序列为Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为963.15；多肽有机化合物e的氨基酸序列为Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为902.07；多肽有机化合物f的氨基酸序列为Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为1031.18；多肽有机化合物g的氨基酸序列为Cys-His-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-Thr-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为987.13；多肽有机化合物h的氨基酸序列为Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，(其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键)，分子量为951.14。
实施例2水苏糖竞争性ELISA实验试验方法在96孔酶标板中包被100μl抗B型血单克隆抗体4℃过夜，用5％BSA 37℃封闭2小时，然后用TBS洗板3次，加入100μl阳性噬菌体和终浓度分别为100、20、4、0.8、0.16、0.032mM的水苏糖混合液反应1小时，另设不加水苏糖的阳性噬菌体液作为空对照。用含0.1％Tween 20的TBS洗板6次，加入100μl辣根过氧化物酶标记抗M13抗体，结合1小时，用含0.1％Tween 20的TBS洗板6次，TMB进行显色，用酶标仪测定吸光度。计算抑制率按照公式[A450(-s)-A450(+s)]/A450(-s)×100％，A450(-s)为未加水苏糖的吸光度，A450(+s)为加入水苏糖的吸光度。
试验结果水苏糖能有效的抑制多肽与抗体的结合，说明水苏糖与多肽结合于抗体的同一位置，即α-Gal抗原表位结合位点。这说明了阳性克隆很可能就结合在水苏糖与抗B型血单克隆抗体结合的位点。结果参见图1，2，。实验发现，总体来说，水苏糖对环肽比线性多肽抑制率要高，说明筛选的线性多肽比环状多肽对抗体的亲和力强。
以上实例说明了多肽有机化合物与抗B单克隆抗体的结合位点(α-Gal结合位点)是特异性的，正好起到封闭抗B单克隆抗体作用，从而避免了由于作用位点特异性不强而带来的副作用。
实施例3多肽抑制人血清与猪红细胞的凝集反应试验方法先把制备好的新鲜1％猪红细胞悬浮在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中备用。在U型血凝板的孔里，40μl多肽用磷酸缓冲液依次逐孔倍比稀释后，每孔分别加入40μl适当稀释的A型人血清和40μl 1％的猪红细胞。然后把此的混合液在室温下先用震荡器震荡1分钟，再静置1小时后观察凝集结果。如果红细胞沉淀到孔的底部，呈一边缘光滑的圆点，则此为没有凝集。如果红细胞形成一网络，并不下沉到孔底呈一边缘光滑的圆点，此为出现凝集。试验设空、阳性和阴性对照。
试验结果此多肽预先能与A型人血清中的抗α-Gal抗体结合，使其失活。这样此抗体就不能再与猪红细胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原结合，从而阻断人抗α-Gal抗体引起的猪红细胞凝集反应。结果参见图3。在图3中，A1～A2，H1～H2，01～02均是空白对照，用40μl 1％的猪红细胞和80μl磷酸盐缓冲液混匀后静置1小时，红细胞沉于凝集板底部，出现光滑圆点，此结果表明没有出现凝集。A3～A4，H3～H4，03～04为阳性对照，用40μl 1％的猪红细胞，40μl1％人血清，和40μl磷酸盐缓冲液混匀后静置1小时，红细胞没有下沉呈现光滑圆点，而是呈现网络状结构，出现凝集。B，B’两条均为水苏糖抑制猪红细胞凝集实验的结果，在1～4孔中依次加入了40μl用磷酸盐缓冲液稀释的不同浓度的水苏糖(浓度依次为200mM，40mM，8mM，1.6mM)，然后加入40μl 1％的猪红细胞和40μl 1％人血清，混匀后静置1小时。B1～B2、B’1～B’2没有出现凝集，B3、B’3开始有网络状结构出现，有明显凝集的现象，说明水苏糖能抑制由人天然抗α-Gal抗体诱发的猪红细胞凝集。C1-4和C’1-4为噬菌体展示肽a抑制猪红细胞凝集实验的结果，在1～4孔中依次加入了用磷酸盐缓冲液稀释的不同浓度的噬菌体(浓度依次为0.1mM，0.02mM，0.004mM，0.0008mM)40μl，再加入40μl 1％的猪红细胞和40μl 1％人血清，混匀后静置1小时。C1，C’1没有出现凝集，C2，C’2开始有网络状结构出现，有明显凝集的现象。E1-4和E’1-4，I1-4和I’1-4，J1-4和J’1-4，K1-4和K’1-4，L1-4和L’1-4，M1-4和M’1-4，P1-4和P’1-4，Q1-4和Q’1-4，分别是噬菌体展示肽b，h，e，k，d，g，c，f的实验结果，实验方法和噬菌体浓度如前。除了噬菌体展示肽k(其氨基酸序列为Ser-Ser-Thr-Ile-Ala-Asn-Thr)，各噬菌体克隆均能在0.1mM浓度下有效地抑制凝血，噬菌体展示肽k可能对抗体结合能力不足，未能明显抑制凝血。G1-4和N1-4为未经过筛选的野生型噬菌体(阴性对照)，分别来自线性7肽库和C7C肽库，均出现凝集。D1-4和D’1-4，F1-4和F’1-4，R1-4和R’1-4分别是化学合成的多肽a，b，f的实验结果，实验方法如前，多肽浓度均依次为20mM，4mM，0.8mM，0.16mM，可见多肽a和b在浓度为4mM时可抑制凝血，而多肽f需要的浓度是20mM。S1-4为阴性对照，加入的多肽序列为Cys-Val-Gln-Pro-Ser-His-Ser-Ser-Cys，均出现凝集；上述结果重复3次，呈现良好的一致性。
以上实例用形象而直接的方式说明了多肽有机化合物除了能与抗B单克隆抗体结合外，还能与人体内预存的抗猪抗原的抗体(抗α-Gal抗体)特异性结合，从而封闭它的作用，可以抑制人天然抗体(抗α-Gal抗体)触发的异种移植超急性排斥反应的发生。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1.一种多肽有机化合物，其特征是提供的多肽有机化合物选自a、b、c、d、e、f、g、h八种中的一种，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连，其中多肽有机化合物a的氨基酸序列为Phe-Hi s-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser，分子量为915.96；多肽有机化合物b的氨基酸序列为Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量为963.06；多肽有机化合物c的氨基酸序列为Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量为763.86；多肽有机化合物d的氨基酸序列为Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys，其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键，分子量为963.15；多肽有机化合物e的氨基酸序列为Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键，分子量为902.07；多肽有机化合物f的氨基酸序列为Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键，分子量为1031.18；多肽有机化合物g的氨基酸序列为Cys-His-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-Thr-Cys，其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键，分子量为987.13；多肽有机化合物h的氨基酸序列为Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，其中第1位的Cys与第9位的Cys之间形成二硫键，分子量为951.14。
2.根据权利要求1所述的多肽有机化合物的应用，其特征是在制备治疗器官移植术中控制异种移植中超急性排斥反应的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种多肽有机化合物，选自a、b、c、d、e、f、g、h八种中的一种，分子量分别为915.96、963.06、763.86、963.15、902.07、1031.18、987.13、951.14，能与抗B型血单克隆抗体特异性结合，溶于水，各氨基酸之间通过肽键相连。本发明的多肽有机化合物能与人体内预存的抗猪抗原的抗体特异性结合，从而封闭它的作用；可以特异地阻断异种器官移植超急性排斥反应，与人体内预存的天然抗α－Gal抗体的结合位点是特异性的，正好起到封闭抗体作用，但不影响人体的整体免疫反应，可避免常用免疫抑制剂引起的副作用。
文档编号A61K38/08GK1831003SQ20061005016
公开日2006年9月13日 申请日期2006年3月31日 优先权日2006年3月31日
发明者詹金彪, 郎建社, 许林海, 严志焜 申请人:浙江大学